孟文文，王 旭，孫向婉，王 蕓，李春曉，張 慧，沈 靜，董 虹

（北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)（中醫(yī)藥）北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206）

隨著中醫(yī)藥事業(yè)的迅速發(fā)展，中成藥生產(chǎn)量逐年攀升 ，隨之產(chǎn)生的中藥渣排放量高達(dá)1 200萬(wàn)t/年[1]。目前，絕大多數(shù)藥渣通過(guò)堆放、填埋、焚燒等方式進(jìn)行處理[2]，對(duì)周圍環(huán)境造成嚴(yán)重污染 。另外，中藥藥材提取工藝比較單一，有效成分的提取率一般僅為30%～70%[3]，因此中藥渣中仍然殘留一些活性物質(zhì)，具有一定的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值[4]。一些中藥渣開(kāi)發(fā)成動(dòng)物飼料可以增強(qiáng)動(dòng)物的免疫功能、促進(jìn)生長(zhǎng)，從而減少抗生素使用，如水飛薊藥渣可提高豬體重[5]，黃芪藥渣可改變雞肉品質(zhì)[6]，紅景天藥渣可增強(qiáng)肉雞的抗病能力[7]等。

黑曲霉作為被允許直接添加到飼料中的微生物之一，可產(chǎn)生纖維素酶、果膠酶等豐富的酶系[8]，這些酶能降解植物細(xì)胞壁的粗纖維成分，有利于有效成分的析出, 具體析出的有效成分根據(jù)其發(fā)酵的原料藥而定。玉屏風(fēng)口服液由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)3味藥組成，是扶正固本的名方，主要作用是提高機(jī)體免疫力[9]，在臨床上使用廣泛。傳統(tǒng)的玉屏風(fēng)口服液是通過(guò)水提獲取，提取方式比較單一，其藥渣中可能含有較多的營(yíng)養(yǎng)成分。因此，本試驗(yàn)對(duì)玉屏風(fēng)口服液藥渣的黑曲霉發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)醇提法提取其有效成分，并對(duì)其藥效學(xué)進(jìn)行考察，為玉屏風(fēng)口服液藥渣的再利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 昆明小鼠[SPF級(jí)，動(dòng)物合格證號(hào)；SCXK（軍）2012-0004]，雌性，13～22 g，購(gòu)于中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

黑曲霉（ATCC16404）購(gòu)于上海復(fù)祥生物有限公司；玉屏風(fēng)口服液藥渣購(gòu)于保定冀中藥業(yè)有限公司；環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CP）購(gòu)于Sigma公司；色譜乙腈、甲醇分析純購(gòu)于塞默飛世爾科技有限公司。

超凈工作臺(tái)（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，型號(hào)：DL-CF-IND）；全溫振蕩培養(yǎng)箱（上海上登實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào)：HZQ160）；超純水儀（美國(guó)Millipore公司，批號(hào)Milli-QA10）；恒溫培養(yǎng)箱（太倉(cāng)市試驗(yàn)設(shè)備廠，型號(hào)HZQ-F160）；全自動(dòng)高壓滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司，型號(hào)TMQR-3850）；高壓液相色譜儀（型號(hào)：Waters 2695）。

1.2 黑曲霉發(fā)酵玉屏風(fēng)口服液藥渣的發(fā)酵條件篩選

1.2.1 菌種的活化與制備 將黑曲霉標(biāo)準(zhǔn)凍存管置于室溫，待融化后接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱30 培養(yǎng)3 d，然后將活化后的黑曲霉用適量無(wú)菌超純水洗脫，制成孢子懸液，轉(zhuǎn)接于100 mL液體馬鈴薯培養(yǎng)基中，濃度調(diào)為1×107個(gè)/mL，于恒溫震蕩培養(yǎng)箱30 ，150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，即可用于接種發(fā)酵。1.2.2 單因素試驗(yàn) 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶活力的影響：將菌液按接種量10%、含水量50%接種到10 g藥渣中，于30 、150 r/min分別在24、48、72、96、120、144 h條件下進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定纖維素酶活大小，確定最佳的發(fā)酵時(shí)間。

接種量對(duì)酶活力的影響：將菌液按上步過(guò)程測(cè)得的最佳發(fā)酵時(shí)間和50%的含水量接種于10 g藥渣中，分別在接種量 6%、8%、10%、12%、14%和16% 條件下進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定纖維素酶活大小，確定最佳的接種量。

含水量對(duì)酶活力的影響：將菌液按上2步測(cè)得的最佳發(fā)酵時(shí)間和接種量接種于10 g藥渣中，分別在含水量30%、40%、50%、60%、70%和80%條件下進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定纖維素酶活大小，確定最佳含水量。

1.2.3 發(fā)酵藥渣最佳發(fā)酵條件的確定 據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取時(shí)間、接種量和含水量3個(gè)因素作為試驗(yàn)因子，每個(gè)因素下選取纖維素酶活最高的3個(gè)水平作正交發(fā)酵試驗(yàn)，通過(guò)產(chǎn)纖維素酶活來(lái)確定藥渣接種發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)。

1.2.4 纖維素酶活的測(cè)定 按上述設(shè)置的試驗(yàn)條件發(fā)酵結(jié)束后，取1 g發(fā)酵物，溶于10 mL醋酸緩沖溶液，置于搖床中，50 ，150 r/min，2 h提取，6 000 r/min離心10 min，取上清液以DNS法檢測(cè)上清液中纖維素酶的活性。

1.3 發(fā)酵玉屏風(fēng)口服液藥渣提取物的制備 玉屏風(fēng)口服液藥渣干燥后粉碎過(guò)篩，稱取100 g于100 mL錐形瓶中，高壓滅菌后按1.2中測(cè)得的最佳的發(fā)酵條件接種于藥渣中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵完以后4 儲(chǔ)存。將藥渣發(fā)酵物與未發(fā)酵物，用10 倍量的70%乙醇，70 水浴提取2次，每次1 h，過(guò)濾，合并提取液，將提取液旋轉(zhuǎn)濃縮蒸發(fā)干燥成粉末，4 保存。

1.4 藥效學(xué)評(píng)價(jià)

1.4.1 發(fā)酵藥渣對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響 將40只雌性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為對(duì)照組、模型組、未發(fā)酵組和發(fā)酵組。飼養(yǎng)溫度（20±1） ，基礎(chǔ)顆粒飼料飼喂，自由取食，飲水，定期更換墊料和飲水。未發(fā)酵組灌服沒(méi)有發(fā)酵的玉屏風(fēng)口服液藥渣提取液，發(fā)酵組灌服經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后的玉屏風(fēng)口服液藥渣提取液，2組均按1.0 g/kg計(jì)量，灌喂給藥0.2 mL/只，對(duì)照組和模型組灌服蒸餾水，0.2 mL/只，連續(xù)灌胃7 d。試驗(yàn)結(jié)束前3 d，除對(duì)照組外，其他各組小鼠均采用腹腔注射環(huán)磷酰胺60 mg/kg（0.2 mL/只·d），連續(xù)注射3 d，制造免疫抑制模型。第8天脫頸椎處死小鼠，并取小鼠胸腺和脾臟，計(jì)算免疫器官指數(shù)：

1.4.2 發(fā)酵藥渣對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響 將30只13 g左右雌性昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為對(duì)照組、未發(fā)酵組和發(fā)酵組。飼養(yǎng)溫度（20±1） ，基礎(chǔ)顆粒飼料飼喂，自由取食，飲水，定期更換墊料和飲水。未發(fā)酵組和發(fā)酵組分別灌服相應(yīng)藥渣的提取液，按照0.2 g/kg劑量，灌胃給藥0.2 mL/只，對(duì)照組灌服相應(yīng)劑量的蒸餾水，連續(xù)灌胃13 d。于試驗(yàn)第1、4、7、10、14天測(cè)定小鼠體重，并分別記錄投料量和剩余料，計(jì)算增重及耗料增重比。

1.5 HPLC分析玉屏風(fēng)口服液藥渣發(fā)酵前后有效成分的變化 選擇 Waters 2695色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）；0.05 %磷酸（A）～乙腈（B）梯度洗脫（0～10 min，100%～95% A，10～20 min，95%～85% A，20～40 min，85%～75% A）；流速1 mL/mim；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量20 μL；柱溫25 。

樣品制備：稱取4 保存的發(fā)酵和未發(fā)酵藥渣提取物的干燥粉末各20 mg，溶于2 mL超純水，0.22 μm小濾器過(guò)濾到色譜瓶上樣。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行，用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行多組間比較分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件的篩選 由圖1～3可知，以時(shí)間為變量，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)，藥渣發(fā)酵后酶活最高；以接種量為變量，當(dāng)接種量為12%時(shí)，酶活最高；以含水量為變量，當(dāng)含水量為50%時(shí)，酶活最高。

圖1 時(shí)間對(duì)產(chǎn)纖維素酶活的影響（接種量10%，含水量50%）

圖2 接種量對(duì)產(chǎn)纖維素酶活的影響（時(shí)間72 h，含水量50%）

圖3 初始含水量對(duì)產(chǎn)纖維素酶活的影響（時(shí)間72 h，接種量12%）

根據(jù)單因素試驗(yàn)的藥渣發(fā)酵結(jié)果，以表1對(duì)應(yīng)的因素水平進(jìn)行發(fā)酵，表2正交結(jié)果表明，確定藥渣發(fā)酵后纖維素酶活最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B3C1，即時(shí)間（A）72 h、接種量（B）12%、含水量（C）40%，此條件下酶活最高。經(jīng)極差分析，RA=1.22＞RB=0.74＞RC=0.35，影響因素大小順序?yàn)楹浚窘臃N量＞時(shí)間，且由最佳發(fā)酵條件處理的纖維素酶活為3.94 IU/g。

2.2 發(fā)酵藥渣對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響 由圖4可知，與對(duì)照組相比，模型組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)極顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明模型制備成功；未發(fā)酵、發(fā)酵藥渣與模型組均無(wú)差異（P＞0.05），說(shuō)明未發(fā)酵與發(fā)酵藥渣提取物對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官均沒(méi)有改善作用。

表1 正交因素水平表

表2 正交試驗(yàn)直觀分析表

圖4 發(fā)酵玉屏風(fēng)口服液藥渣提取物對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響

2.3 發(fā)酵藥渣對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響 由圖5可知，發(fā)酵組小鼠增重顯著高于對(duì)照組和未發(fā)酵組（P＜0.05），未發(fā)酵組小鼠增重與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明發(fā)酵玉屏風(fēng)口服液藥渣產(chǎn)物可提高小鼠的體重。

由表3可知，在小鼠的不同生長(zhǎng)階段，發(fā)酵組的耗料增重比均低于未發(fā)酵組；與對(duì)照組相比，發(fā)酵組小鼠在5～7、8～10、1～14 d的耗料增重比均低于對(duì)照組。

圖5 發(fā)酵玉屏風(fēng)口服液藥渣提取物對(duì)小鼠增重影響

表3 發(fā)酵玉屏風(fēng)口服液藥渣對(duì)小鼠耗料增重比影響

2.4 玉屏風(fēng)口服液藥渣發(fā)酵前后有效成分的變化HPLC分析結(jié)果顯示，在此色譜條件下，空白溶劑水（圖6-A）無(wú)干擾，發(fā)酵藥渣提取物（圖6-C）水溶后在13.056、13.857 min出現(xiàn)2個(gè)較高的物質(zhì)峰，對(duì)應(yīng)未發(fā)酵藥渣提取物（圖6-B）中保留時(shí)間較一致（13.089、13.948 min）的2個(gè)含量極低的物質(zhì)峰。將未發(fā)酵與發(fā)酵藥渣提取物出峰時(shí)間較為一致的峰面積比較（圖6-D），可以看出發(fā)酵藥渣提取物水溶后13.082、13.895 min處的峰面積分別約為未發(fā)酵藥渣提取物13.079、13.936 min處峰面積的20倍和50倍，說(shuō)明藥物經(jīng)發(fā)酵后有2種有效成分的含量明顯增加。

圖6 發(fā)酵與未發(fā)酵玉屏風(fēng)口服液藥渣圖譜

3 討 論

本研究采用正交試驗(yàn)，旨在以較少的試驗(yàn)找到試驗(yàn)因素的最佳水平，以得到試驗(yàn)所需量的目標(biāo)產(chǎn)物。纖維素酶的活性可以直接表明植物細(xì)胞壁的降解程度，間接表明植物細(xì)胞內(nèi)容物放出的程度，故以纖維素酶的活性高低來(lái)衡量發(fā)酵程度。通過(guò)篩選最佳發(fā)酵條件，使黑曲霉發(fā)酵藥渣降解細(xì)胞壁纖維素的能力達(dá)到最佳，對(duì)提高中藥的有效成分具有重要意義。本試驗(yàn)最終確定最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B3C1，即時(shí)間72 h、接種量12%、含水量40%，此條件下酶活最高，為3.94 IU/g。經(jīng)極差分析，影響因素大小順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間＞接菌量＞含水量。戴等[10]采用黑曲霉發(fā)酵中草藥，以纖維素酶活和果膠酶活為指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定最佳發(fā)酵條件（總發(fā)酵時(shí)間為96 h，好氧厭氧發(fā)酵時(shí)間比為2 : 1，接種比例為2 %，pH為5），提高了藥物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。可見(jiàn)，不同的發(fā)酵時(shí)間、接種量、含水量都可影響黑曲霉發(fā)酵藥渣產(chǎn)纖維素酶活的高低。

玉屏風(fēng)口服液是中醫(yī)扶正固表的經(jīng)典方劑，具有益氣、固表、止汗的功能[11]，并可提高環(huán)磷酰胺造成的免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)，影響固有免疫、體液免疫及細(xì)胞免疫[12]。環(huán)磷酰胺造成的免疫抑制模型通常會(huì)造成免疫器官指數(shù)降低，其中胸腺、脾臟指數(shù)可用來(lái)評(píng)價(jià)小鼠的免疫狀況[13]。研究表明，具有提高免疫力作用的中藥或成分通?？苫謴?fù)免疫抑制小鼠的免疫器官指數(shù)[14-15]。因此，本試驗(yàn)通過(guò)建立環(huán)磷酰胺造成的免疫抑制小鼠模型來(lái)評(píng)價(jià)發(fā)酵藥渣對(duì)免疫器官指數(shù)影響。本研究結(jié)果顯示，模型組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均較對(duì)照組顯著降低，表明免疫抑制模型建立成功；但與模型組相比，未發(fā)酵和發(fā)酵藥渣提取物均未能提高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，說(shuō)明發(fā)酵藥渣提取物對(duì)免疫抑制小鼠的免疫器官?zèng)]有改善作用，對(duì)其免疫狀況影響不大，這與敖楊等[16]的研究結(jié)果不一致，可能因?yàn)橛衿溜L(fēng)口服液在提取過(guò)程中已將能提高免疫力的有效成分提取完全，藥渣發(fā)酵后也幾乎不含有此類成分。

中藥渣經(jīng)過(guò)發(fā)酵后有利于其成分析出和被動(dòng)物機(jī)體吸收利用，為機(jī)體提供大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵藥渣提取物可顯著提高小鼠的體重，降低耗料增重比，原因很可能由于黑曲霉發(fā)酵和降解細(xì)胞壁的作用，促進(jìn)了上述2種有效成分的析出，從而使發(fā)酵后的藥渣具備一定的藥效學(xué)作用。楊東川等[17]采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵紅參藥渣，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵藥渣可以提高小鼠的生長(zhǎng)性能和繁殖性能。趙倩等[18]采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵中藥制劑，發(fā)現(xiàn)飼料中添加發(fā)酵中藥可顯著提高鯉魚的生長(zhǎng)性能。謝炎福等[19]采用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵復(fù)方中藥，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵中藥與未發(fā)酵相比可顯著提高幼魚體重。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黑曲霉發(fā)酵玉屏風(fēng)口服液藥渣提取物具有促生長(zhǎng)效果，與上述研究結(jié)果較為一致。這說(shuō)明無(wú)論是中藥還是中藥渣在經(jīng)微生物發(fā)酵后，可能產(chǎn)生一些利于機(jī)體吸收的成分，加強(qiáng)機(jī)體代謝，可產(chǎn)生促生長(zhǎng)的效果。

經(jīng)HPLC試驗(yàn)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，玉屏風(fēng)口服液藥渣經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后有2種有效成分的含量有所增加?？赡芤?yàn)楹谇咕哂泻铣珊头置诶w維素等酶的特點(diǎn)，在發(fā)酵過(guò)程中破壞了細(xì)胞壁，從而促進(jìn)了這2種成分的析出。韓春楊等[20]利用HPLC法檢測(cè)中藥制劑發(fā)酵前后的變化，發(fā)現(xiàn)一些成分含量增加，且出現(xiàn)了新的吸收峰。可見(jiàn)，通過(guò)微生物的降解作用，能最大限度地提取藥物有效成分和活性物質(zhì)，并出現(xiàn)新的藥物成分，這可能是中藥發(fā)酵后藥效增強(qiáng)的主要機(jī)制[21]。本試驗(yàn)所用的玉屏風(fēng)口服液藥渣經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，有些成分的含量發(fā)生了改變，但該成分具體是什么，還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

黑曲霉發(fā)酵玉屏風(fēng)藥渣對(duì)免疫抑制小鼠的免疫器官指數(shù)的恢復(fù)作用不大，但對(duì)小鼠有一定的促生長(zhǎng)作用，這為玉屏風(fēng)口服液藥渣的再利用提供了一定的參考依據(jù)。