安雪姣，趙生國，潘章源，田志龍，張效生，張金龍，蔡 原*，儲明星*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，甘肅蘭州 730070；3.臨沂大學農(nóng)林科學學院，山東臨沂 276005；4.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

在動物的季節(jié)性繁殖中，甲狀腺激素（TH）主要通過KiSS-1/GPR54和TSHB-DIO2/DIO3這2條通路發(fā)揮調(diào)控作用[1-2]。其中，脫碘酶2（DIO2）和脫碘酶3（DIO3）是催化不同活性TH相互轉(zhuǎn)化的關鍵酶，它們的表達變化受到松果體中褪黑激素的調(diào)控，與季節(jié)的變換有顯著相關性[3-6]。DIO2可以催化甲狀腺素（T4）轉(zhuǎn)化為活性更強的三碘甲狀腺原氨酸（T3），而DIO3則催化T4、T3轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性的反式T3和二碘甲狀腺原氨酸（T2）。DIO2和DIO3的活性變化能動態(tài)平衡T3、T4濃度的相對穩(wěn)定[7]。研究發(fā)現(xiàn)，敘利亞倉鼠在長日照（休情）時，下丘腦DIO2表達顯著增加，T3濃度上升，而短日照（發(fā)情）時DIO2表達明顯減少，T3濃度降低[4]。薩能奶山羊在長日照時繁殖受到抑制，短日照時繁殖性能被激活，其繁殖狀態(tài)的變化可能與下丘腦弓狀核（ARC）DIO2基因的表達對下丘腦基底核上T3水平的調(diào)控相關[8]。鵪鶉在長日照時下丘腦內(nèi)側(cè)基底部（MBH）的T3、T4濃度與短日照相比大約增加了10倍，這說明在長日照時DIO2表達增加，DIO3表達減少[9]。目前，對于季節(jié)性發(fā)情基因在不同繁殖狀態(tài)下綿羊下丘腦-垂體-卵巢生殖軸各組織表達規(guī)律的研究很少。本研究擬以常年發(fā)情的小尾寒羊為研究對象，分別采集其黃體期和卵泡期生殖軸上的10種組織（下丘腦、垂體、松果體、大腦、小腦、卵巢、子宮、輸卵管、腎臟、腎上腺），利用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）技術檢測DIO2和DIO3基因在不同繁殖狀態(tài)下小尾寒羊不同組織中的表達差異，初步分析這2個基因在綿羊繁殖狀態(tài)轉(zhuǎn)化中的關系，為揭示小尾寒羊常年發(fā)情的分子機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品 隨機選擇山東鄆城的營養(yǎng)狀況良好、體重一致的2～3周歲經(jīng)產(chǎn)空懷小尾寒羊母羊6只，飼養(yǎng)于天津市畜牧獸醫(yī)研究所試驗羊場，并保證其飼養(yǎng)管理方式、飼料配方和環(huán)境一致。放置孕酮陰道栓（CIDR）并注射5～6 mL維生素AD以保護陰道內(nèi)膜。放栓12 d后撤栓，撤栓當天記為1 d，撤栓時刻記為0 h。撤栓后用腹腔鏡觀察卵泡發(fā)育和排卵情況來確定卵泡期采樣時間，用公羊試情確定母羊發(fā)情狀態(tài)及時間。連續(xù)2個情期后分別在撤栓后45 h（卵泡期）和10 d（黃體期）進行屠宰，每個時期各3 只，屠宰后迅速采集下丘腦、垂體、松果體、大腦、小腦、卵巢、子宮、輸卵管、腎臟、腎上腺共10種組織，放入液氮中，并帶回實驗室至-80冰箱保存。

1.2 總 RNA 提取 使用 Trizol（Invitrogen，美國）和動物組織總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取各組織總RNA。用Nanodrop2000檢測所提取RNA的濃度和純度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.3 引物設計 參考GenBank綿羊DIO2和DIO3基因mRNA序列（GenBank登錄號：XM_015097211.1和NM_001122650.1），利用Primer Premier 5.0軟件進行跨外顯子引物設計，以β-actin（NM_001009784）作為內(nèi)參基因。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。引物詳細信息見表1。

表1 綿羊DIO2和DIO3基因的引物信息

1.4 cDNA合成 使用cDNA快速合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系總體積為20 μL。反應條件：37 15 min，85 5 s，全程在冰上操作。反轉(zhuǎn)錄后經(jīng)5倍稀釋，用持家基因β-actin進行PCR檢測。

1.5 實時熒光定量PCR

1.5.1 標準曲線的建立 取每個經(jīng)檢測合格后的cDNA樣品2 μL混勻，按1:2濃度梯度稀釋，分別獲得8個濃度梯度（1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128）的cDNA樣品。以這些cDNA為模板對目的基因和持家基因進行熒光定量PCR，并繪制目的基因和持家基因標準曲線，確保引物擴增效率在95%～105%。

1.5.2 實時熒光定量PCR體系和程序 利用羅氏480Ⅱ型熒光定量PCR儀檢測不同時期小尾寒羊在繁殖相關組織中DIO2和DIO3基因的表達，β-actin作為內(nèi)參基因，每個樣品做3個重復。反應體系總體積為20 μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA （250 μg/μL）2 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL。qPCR程序：95 預變性5 s，95 變性5 s，60 30 s，45個循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計分析 采用2-△△Ct法[10-11]計算目的基因相對表達量，用SPSS 19.0進行單因素方差分析，結果用平均值±標準誤來表示，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果分析

2.1 總RNA提取與cDNA合成 用Nanodrop2000檢測各組織總RNA，發(fā)現(xiàn)濃度均在100 mg/μL以上，A260/A280均在1.80～2.10；利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)RNA完整性良好，28S條帶亮度大于18S，且二者均無明顯降解（圖1）。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA通過β-actin持家基因檢測后發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物干凈單一，沒有基因組DNA污染（圖2），說明提取的RNA和反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA可用于后續(xù)的熒光定量PCR。

圖1 小尾寒羊8個組織RNA結果

圖2 不同時期小尾寒羊10種組織中β-actin持家基因RT-PCR擴增產(chǎn)物

2.2DIO2和DIO3在不同時期小尾寒羊各組織中的表達如圖3、4所示，DIO2和DIO3基因在兩個時期小尾寒羊的10種組織均有一定表達，在腎上腺和腎臟中表達量均很低。黃體期和卵泡期垂體DIO2基因的表達量顯著高于其他組織（P＜0.05）；黃體期DIO2基因在垂體、子宮、下丘腦、松果體、輸卵管和卵巢的表達量顯著高于卵泡期（P＜0.05）。DIO3基因的表達量在卵泡期松果體中顯著高于其他組織（P＜0.05），但在黃體期差異不顯著（P＞0.05）；卵泡期DIO3基因在松果體、下丘腦、子宮、垂體和輸卵管的表達量顯著高于黃體期（P＜0.05）。

圖3 DIO2基因在小尾寒羊不同繁殖時期各組織中的表達

圖4 DIO3基因在小尾寒羊不同繁殖時期各組織中的表達

3 討 論

3.1DIO2基因?qū)π∥埠蚍敝车挠绊慏IO2基因在大鼠的大腦、小腦、甲狀腺和睪丸中有一定表達[12-14]，在布氏田鼠的下丘腦、大腦和小腦中也有一定表達[15]。DIO2基因主要在人的大腦、海馬、下丘腦和小腦中表達，另外在腹部脂肪組織和子宮內(nèi)膜也有一定表達[16-18]。蟾蜍中DIO2基因在胚胎后腦、鼻、尾、眼、肝臟和腸等多個組織廣泛表達[19]。在濟寧青山羊和遼寧絨山羊上的研究發(fā)現(xiàn)，DIO2基因在其大腦、小腦、下丘腦、垂體、卵巢、子宮等多個組織均有表達，且在垂體和子宮中表達較高[20]。也有研究表明，DIO2基因在嚙齒動物的下丘腦高表達[21]。本研究檢測到DIO2基因在小尾寒羊下丘腦、垂體、卵巢、腎臟、大腦、松果體、小腦、腎上腺、子宮和輸卵管中均表達，且在垂體中高表達，這與黃冬維等[20]的結果一致，但跟嚙齒動物[21]（下丘腦高表達）的研究結果不一致，可能是由于DIO2基因的表達模式存在種屬特異性。

DIO2基因通過介導光周期信號調(diào)節(jié)下丘腦局部TH濃度的變化來影響促性腺激素釋放激素（GnRH）的分泌。研究發(fā)現(xiàn)，季節(jié)性繁殖的薩能奶山羊和索厄島綿羊在長日照時，下丘腦正中隆起部位的DIO2基因表達升高，導致下丘腦MBH的T3水平降低，繁殖活動受到抑制[8,22]。鵪鶉和敘利亞倉鼠在長光照時DIO2基因的表達量上升，使下丘腦中T3濃度增加；而在短光照時DIO2基因的表達量降低，下丘腦中T3濃度減少[4-5]。黑線倉鼠在春、秋季（發(fā)情）DIO2基因的表達量較高，夏季（休情）較低，這與GnRH的季節(jié)性表達模式一致，并且在長光照條件下的DIO2表達量顯著高于短光照[23]。這些都有力地支持了本實驗中DIO2基因在小尾寒羊黃體期表達量高于卵泡期的結果，暗示DIO2基因?qū)d羊的生殖活動起抑制作用。

3.2DIO3基因?qū)π∥埠蚍敝车挠绊慏IO3基因在幼齡西伯利亞倉鼠和成年大鼠的下丘腦中均有表達[24]。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠的大腦、小腦、海馬和心肌細胞中也檢測到了DIO3基因表達[13,25]。在成年奶牛中，DIO3基因在心、肝、脾、肺、腎、骨骼肌和脂肪組織中都有表達[26]。在人和小鼠中，DIO3基因主要在肝臟、皮膚、腦、子宮、胎盤中表達，并且在胎兒體內(nèi)表達量更高[27-28]。DIO3基因在豬的大腦、肺臟、脾臟、心臟、胃和肌肉等組織中均有表達，且在1月齡豬的腦組織中表達量很高，但在相同月齡山羊上是肝臟中表達量很高，心、肝、肺和腦次之[29]。本研究在不同時期小尾寒羊的10種繁殖器官中均檢測到DIO3基因的表達，但其表達水平與以上研究結果有所不同，本研究中DIO3基因在松果體、下丘腦和卵巢中的表達量較高，說明DIO3基因的表達模式也具有物種特異性。

動物機體內(nèi)脫碘酶的活性與濃度在控制T4水平上起至關重要的作用。DIO3mRNA能根據(jù)T4的狀態(tài)調(diào)控T3的活性，使T4濃度剛好適合機體局部需要[30]。黃冬維等[20]研究發(fā)現(xiàn)，DIO3基因在常年發(fā)情的濟寧青山羊下丘腦的表達量顯著高于季節(jié)性發(fā)情的遼寧絨山羊。季節(jié)性繁殖的索厄島綿羊在短日照時DIO3基因mRNA表達量高于長日照[22]。黑線倉鼠下丘腦中DIO3基因的表達在春、秋季顯著高于夏季，而且在短光照卵巢中的表達量顯著高于長光照[24]。這些都與本研究結果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，卵泡期DIO3基因在松果體的表達量顯著高于黃體期，可能是由于在綿羊和嚙齒動物中TSHR基因主要表達于垂體結節(jié)部（PT）和第三腦室底部（EC）[31]，而EC是DIO2和DIO3在腦內(nèi)的主要表達位點[32]，并且TSH及其受體TSHR是光照周期調(diào)控季節(jié)性繁殖的主要因子，其表達均隨日照長短而發(fā)生變化[33]。因此，DIO3基因在卵泡期松果體中的高表達可能由于PT（垂體）-TSH-TSHR-DIO2/DIO3（下丘腦）-TH-GnRH通路[34]連接了松果體中褪黑激素（MEL）光周期分泌信號和GnRH合成釋放來實現(xiàn)綿羊不同繁殖狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)化，但其在綿羊繁殖中的具體調(diào)控作用還值得深入研究。

4 結 論

DIO2基因在小尾寒羊黃體期垂體、子宮、下丘腦、松果體、輸卵管和卵巢的表達量均顯著高于卵泡期，說明其可能在小尾寒羊發(fā)情狀態(tài)轉(zhuǎn)換中起抑制作用。DIO3基因在小尾寒羊卵泡期松果體、下丘腦、子宮、垂體和輸卵管的表達量顯著高于黃體期，提示其可能在小尾寒羊黃體期到卵泡期發(fā)情狀態(tài)轉(zhuǎn)換中起促進作用。