徐 忠，張 哲，孫 浩，張向喆，徐寧迎，陳究成，華堅(jiān)青，鐘土木，王起山*，潘玉春,4*

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.浙江大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江杭州 310058；3.浙江加華種豬有限公司，浙江金華 3210534；上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

金華豬具有成熟早、產(chǎn)仔多、骨細(xì)皮薄、肉品質(zhì)好等優(yōu)良特性，是我國(guó)豬種資源中一份極為寶貴的遺產(chǎn)。隨著外來(lái)豬種的引進(jìn)，金華豬的飼養(yǎng)數(shù)量快速下降。為了保護(hù)這一品種，選擇金華豬與西方品種的雜交利用成為有效途徑。雜種優(yōu)勢(shì)是指兩親本雜交以后，雜種后代表現(xiàn)出生長(zhǎng)、抗逆性、豐產(chǎn)性和品質(zhì)等方面比雙親優(yōu)越的現(xiàn)象。傳統(tǒng)的雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)主要通過(guò)雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行配合力測(cè)定完成。但是在育種實(shí)踐中，候選二元、三元甚至四元雜交組合繁多，如果對(duì)于每個(gè)可能的組合都進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，將會(huì)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力和費(fèi)錢。因此，采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ陔s交實(shí)驗(yàn)開始之前進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)從而指導(dǎo)雜交實(shí)驗(yàn)就顯得更加切實(shí)可行。

根據(jù)數(shù)量遺傳學(xué)的基本理論，雜種優(yōu)勢(shì)與兩雜交親本之間的遺傳距離呈正比，而在分子水平上構(gòu)建的遺傳距離往往更加準(zhǔn)確[1]。在新一代測(cè)序技術(shù)普及與發(fā)展之前，人們主要利用微衛(wèi)星等稀疏的分子標(biāo)記來(lái)進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)的預(yù)測(cè)，而其預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性還有待考量[2-3]。隨著全基因組范圍的分子標(biāo)記的檢測(cè)成為可能，可供雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)的信息更加龐大。Amuzu-Aweh等[4]利用全基因組53 000多個(gè)SNP研究了白來(lái)航雞純系品種的雜交數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)雜種優(yōu)勢(shì)與親本品系之間的等位基因頻率之差的平方（SDAF）呈正比。而國(guó)內(nèi)外還鮮有全基因組標(biāo)記在豬的雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)上的應(yīng)用報(bào)道。本研究運(yùn)用全基因組范圍的SNP尤其是同各性狀相關(guān)聯(lián)的SNP來(lái)計(jì)算群體間的遺傳距離，進(jìn)而預(yù)測(cè)各種雜交組合的雜種優(yōu)勢(shì)，最后結(jié)合各親本品種的純繁性能，初步篩選出一些可能表現(xiàn)優(yōu)異的雜交模式。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與基因型檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括金華豬57頭[5]和123頭引進(jìn)品種（2005年從美國(guó)引進(jìn)的杜洛克49頭、長(zhǎng)白豬37頭和大白豬37頭）[6]。本研究所采用的測(cè)序方法為本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序的技術(shù)平臺(tái)—GGRS。該技術(shù)平臺(tái)適用于大基因組的遠(yuǎn)交群體，具有操作流程簡(jiǎn)單、易于操作、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。簡(jiǎn)言之，該方法主要包括測(cè)序片段數(shù)設(shè)計(jì)、限制性內(nèi)切酶的選擇、Barcode設(shè)計(jì)和測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建等內(nèi)容，詳細(xì)步驟見陳強(qiáng)等[7]研究。利用“基于最優(yōu)線性無(wú)偏預(yù)測(cè)的基因型填補(bǔ)（iBLUP）”對(duì)缺失基因型進(jìn)行填補(bǔ)[8]。

1.2 確定性狀特異多態(tài)位點(diǎn) 本研究以胴體與肉品質(zhì)、繁殖、健康（血液參數(shù)、疾病易感性和免疫能力等）和生長(zhǎng)4類性狀作為目的性狀。首先，將豬數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.animalgenome.org/cgibin/QTLdb/SS/index）中關(guān)于胴體與肉品質(zhì)、健康、繁殖和生長(zhǎng)4類性狀的QTL篩選出來(lái)。但是1個(gè)QTL的區(qū)段往往很長(zhǎng)，其中包含的基因數(shù)量大，這些基因并非都與性狀相關(guān)。因此，本研究利用R軟件包biomaRt分別獲得包含在這4類QTL中的基因以及其GO（Gene Ontology）注釋。然后，利用R軟件包GOsim通過(guò)分析每一類基因的GO注釋分別與這4類性狀的關(guān)系，從而分別篩選出胴體與肉品質(zhì)、健康、繁殖和生長(zhǎng)等性狀相關(guān)的4類基因集合。最后，將檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)映射到這些基因中從而篩選出分別與4個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)的變異位點(diǎn)。

1.3 群體間性狀特異IBS的構(gòu)建 依據(jù)這些SNP，按照性狀類別，計(jì)算各種雜交組合2種親本群體間的同態(tài)相同率（IBS），即可能的子代純合子頻率。以群體間遺傳距離D=1-IBS作為衡量雜種優(yōu)勢(shì)高低的指標(biāo)。群體i與j之間IBS計(jì)算公式：

其中，m為SNP的總個(gè)數(shù)，s表示第n個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因個(gè)數(shù)，一般為2，pink表示第k個(gè)等位基因在第i個(gè)群體內(nèi)第n個(gè)位點(diǎn)上的等位基因頻率，pjnk表示第k個(gè)等位基因在第j個(gè)群體內(nèi)第n個(gè)位點(diǎn)上的等位基因頻率。

對(duì)于三元或者四元雜交體系，假定其中的二元雜交體系是2個(gè)純種親本群體隨機(jī)交配，根據(jù)其親本群體的各等位基因頻率，即可計(jì)算出生成二元雜種群體的各基因型頻率，對(duì)于后續(xù)的雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)，則可以根據(jù)2個(gè)群體之間的IBS計(jì)算。

值得指出的是，雜種的生產(chǎn)性能（P）不僅取決于雜種優(yōu)勢(shì)部分（H），也取決于加性效應(yīng)部分（2個(gè)親本純繁性能的均值M），即：P=M+H，所以最優(yōu)雜交組合的最終篩選應(yīng)綜合考慮二者。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型數(shù)據(jù) 將這些SNP位點(diǎn)與pigQTLdb（http://www.animalgenome.org/cgi- bin/QTLdb/SS/index）中繁殖、生長(zhǎng)、胴體與肉品質(zhì)、健康等4類性狀的QTL進(jìn)行映射分析以找到落入QTL覆蓋區(qū)間內(nèi)的標(biāo)記SNP。共找到繁殖、生長(zhǎng)、胴體與肉品質(zhì)和健康性狀潛在相關(guān)基因的SNP分別為1 835、2 174、196 057、17 200個(gè)。依據(jù)這些SNP，按照性狀類別，計(jì)算各種雜交組合2種親本群體間遺傳距離。

2.2 不同雜交模式下雜種群的群里間遺傳距離

2.2.1 二元雜交 二元雜交需要重點(diǎn)考慮純種種豬的繁殖性能及二元雜種肉豬的生長(zhǎng)性能、胴體與肉品質(zhì)以及健康。從純種繁殖性能上講，仍然有Y≈L≈J＞D。由圖1可見，二元雜種肉豬的生長(zhǎng)性能、胴體與肉品質(zhì)性狀的雜種優(yōu)勢(shì)排序可能均為L(zhǎng)J＞YJ ＞DJ＞LY；但在健康性狀上，雜種優(yōu)勢(shì)的排序可能為YJ＞ LJ＞ DJ＞LY。

圖1 二元雜種肉豬的群里間遺傳距離

2.2.2 三元雜交 三元雜交需要重點(diǎn)考慮純種（第一母本，祖代）與二元雜種（第二母本，父母代）的繁殖性能、健康以及三元雜種豬的生長(zhǎng)性能、胴體與肉品質(zhì)、健康。

從純種種豬繁殖性能上講，仍然有Y≈L≈J＞D。由圖2可見，三元雜種豬的繁殖和健康性狀的雜種優(yōu)勢(shì)排序可能均為YJ＞LJ＞DJ ＞LY。值得注意的是，LY盡管可能雜種優(yōu)勢(shì)最小，但因L、Y 2個(gè)品種的純繁性能都很高，故其繁殖性能依然可能很高。

由圖3可見，三元雜種在生長(zhǎng)方面的雜種優(yōu)勢(shì)排序可能為 J×LY＞ L×YJ ＞D×LJ＞Y×LJ＞D×YJ，在胴體與肉質(zhì)方面雜種優(yōu)勢(shì)排序可能為 J×LY＞L×YJ＞Y×LJ＞D×LJ＞D×YJ，在健康方面的排序可能為 J×LY＞Y×LJ＞L×YJ＞D×YJ ＞ D×LJ。

圖2 二元雜種豬繁殖性能和健康性狀的群里間遺傳距離

圖3 三元雜種肉豬的群里間遺傳距離

2.2.3 雙雜交 雙雜交需要重點(diǎn)考慮純種（第一母本，祖代）與二元雜種（第二母本，父母代）的繁殖性能、健康以及四元雜種的生長(zhǎng)性能、胴體與肉品質(zhì)、健康。從純種種豬繁殖性能上講，仍然有Y≈L≈J＞D。而對(duì)二元雜種種豬的繁殖性能與健康而言，群里間遺傳距離仍如圖4所示。

圖4 幾種雙雜交雜種的群里間遺傳距離

由圖4可見，四元雜種肉豬長(zhǎng)性能、胴體與肉品質(zhì)、健康性狀雜種優(yōu)勢(shì)的可能排序?yàn)镈J×LY＞ DL×YJ ＞DY×LJ。

2.2.4 各種模式比較 由圖5可見，以上雜交模式在生長(zhǎng)性能方面的雜種優(yōu)勢(shì)排序可能為L(zhǎng)J＞ J×LY＞ YJ＞DJ＞ DJ×LY＞ L×YJ＞ DL×YJ＞ D×LJ＞ Y×LJ＞ D×YJ＞DY×LJ，在胴體與肉品質(zhì)方面雜種優(yōu)勢(shì)排序可能為L(zhǎng)J＞ J×LY＞ YJ＞ DJ＞ L×YJ＞ DJ×LY＞ Y×LJ＞ DL×YJ＞DY×LJ＞ D×LJ＞ D×YJ， 在 健 康 方 面 的 排 序 可 能 為YJ＞ J×LY＞ LJ＞ DJ＞ DJ×LY＞ Y×LJ＞ L×YJ＞ DL×YJ＞D×YJ＞ D×LJ＞ DY×LJ。

圖5 各種雜交模式的群里間遺傳距離

3 討 論

3.1 利用全基因組性狀特異SNP預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用在金華豬雜交體系中是可行的 雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)對(duì)于雜種優(yōu)勢(shì)的利用具有重要意義。雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)的作用在于在雜交實(shí)驗(yàn)開始之前就預(yù)測(cè)出潛在的最優(yōu)組合，從而大幅降低育種成本。而合理地整合各類信息是使預(yù)測(cè)變得更加準(zhǔn)確的有效方法。隨著從表型到基因組的研究逐漸增多，QTLdb這樣一個(gè)整合QTL定位的研究結(jié)果的數(shù)據(jù)庫(kù)也隨之產(chǎn)生，而QTL中所包含的基因是更可能影響其所關(guān)聯(lián)性狀的基因[9]，由于一個(gè)QTL的區(qū)段包含的基因數(shù)量大，而且這些基因并非都與性狀相關(guān)，因此利用了基于GO注釋的語(yǔ)義學(xué)分析軟件GOsim，該軟件可以基于GO詞條的有向無(wú)環(huán)結(jié)構(gòu)來(lái)評(píng)估2個(gè)詞條之間的語(yǔ)義學(xué)關(guān)系，從而可以達(dá)到自動(dòng)注釋基因的目的。至此，候選基因的數(shù)量大幅降低。 本研究提出了一種基于全基因組性狀特異SNP的雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)方法，并將其利用到金華豬雜交體系的構(gòu)建當(dāng)中。

雜種優(yōu)勢(shì)是由等位基因之間的顯性效應(yīng)和非等位基因之間的上位效應(yīng)所產(chǎn)生的，后者由于作用方式復(fù)雜而不易估計(jì)，前者形成的物質(zhì)基礎(chǔ)是雜合子，而IBS是衡量?jī)捎H本產(chǎn)生的雜種后代在某一位點(diǎn)能形成純合子的概率，所以IBS與雜種優(yōu)勢(shì)應(yīng)該呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。性狀特異的分子標(biāo)記在動(dòng)物育種中的應(yīng)用也有報(bào)道，由性狀特異標(biāo)記構(gòu)建的相關(guān)矩陣使得BLUP方法在全基因組選擇的準(zhǔn)確性有所提高[10]。由此可見，性狀特異的分子標(biāo)記雖然減少了計(jì)算中使用標(biāo)記的數(shù)量，但實(shí)際上加入了性狀特異這一“先驗(yàn)”信息，提高了估計(jì)的準(zhǔn)確性。

3.2 雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)雖可篩選出最優(yōu)雜交組合方案，但仍需進(jìn)行實(shí)際配合力實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 二元雜交組合中，生長(zhǎng)性能、胴體與肉品質(zhì)性狀的雜種優(yōu)勢(shì)排序可能均為L(zhǎng)J＞YJ＞DJ＞LY。但在健康性狀上，雜種優(yōu)勢(shì)的排序可能為YJ＞ LJ＞ DJ＞LY。綜合考慮，二元雜交 YJ、LJ、DJ均可選擇，三者差異不大，但考慮到杜洛克在肉品質(zhì)和生長(zhǎng)性狀上的加性效應(yīng)，加上毛色全黑，二元雜交選擇DJ較為合適。三元雜交組合中，需要考慮第一母本和第二母本的繁殖性能、健康性狀等，而DJ、DY、DL因2個(gè)親本品種的純繁性能較低不適宜做父母代母豬。雖然LY的雜種優(yōu)勢(shì)較低，但因L、Y 2個(gè)品種的純繁性能都很高，故其繁殖性能依然可能很高。J×LY在生長(zhǎng)性能、肉品質(zhì)與胴體性狀和健康性狀的雜種優(yōu)勢(shì)均最高，所以在三元雜交中J×LY較為合適。雙雜交組合中，DJ×LY在生長(zhǎng)性能、肉品質(zhì)與胴體性狀和健康性狀的雜種優(yōu)勢(shì)均最高，而且第二父本DJ在二元雜交組合中也是最為合適的，該模式可與二元雜交組合D×J配合使用，所以在四元雜交組合中，DJ×LY較為合適。

從以上11種雜交組合模式統(tǒng)一來(lái)看，LJ、YJ、DJ和J×LY 4種雜交模式在生長(zhǎng)性能、肉品質(zhì)與胴體性狀和健康性狀的雜種優(yōu)勢(shì)均比較高，可能是因?yàn)榻鹑A豬與杜洛克、長(zhǎng)白和大白豬3個(gè)品種的遺傳距離較遠(yuǎn)。而金華豬在這4種雜交組合中，血緣都占了50%，而在其他組合中只占了25%。

雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)可以分別從二元、三元和雙雜交這幾種不同雜交組合方式中篩選出最優(yōu)方案，大大減少了候選雜交實(shí)驗(yàn)，但要從這幾種方案中挑選出最佳組合，仍然需要進(jìn)行配合力實(shí)驗(yàn)。

4 結(jié) 論

本研究利用全基因組性狀特異的SNP分子標(biāo)記估算不同群體間的遺傳距離，從胴體與肉品質(zhì)、繁殖、健康和生長(zhǎng)4類性狀對(duì)金華豬不同雜交模式下的雜種優(yōu)勢(shì)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，篩選出了DJ、J×LY和DJ×LY分別為二元、三元和四元組合中的最優(yōu)選擇，研究結(jié)果為金華豬的保種和雜交利用奠定了理論基礎(chǔ)。