胡明陽，周煥煥，齊曉龍，許月園，趙書紅，趙云霞*，李新云*

（1.華中農業(yè)大學農業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，湖北武漢430070；2.華中農業(yè)大學農業(yè)部豬遺傳育種重點實驗室，湖北武漢430070）

骨骼肌是軀體中最豐富的組織，約占總體重的50%[1]。免疫相關基因可以調控骨骼肌的發(fā)育,如NFKB、 MEF2C、FLOT1及Shh等。核因子KB（Nuclear Factor Kappa B，NFKB）參與免疫應答、炎癥、細胞增殖、細胞凋亡和腫瘤發(fā)生的調控，而在骨骼肌組織中NFκB可以通過調控miRNA497影響骨骼肌的發(fā)育[2-3]。由MEF2C編碼的轉錄因子可以在應激期間促進B淋巴細胞生成，同時MEF2C對胚胎期骨骼肌發(fā)育以及生后期骨骼肌成熟具有重要作用[4-5]。FLOT1編碼的flotillin-1參與傳導炎性TLR3信號，同時FLOT1也參與調控肌肉能量代謝[6-7]。Shh基因可調控胚胎期胸腺細胞的發(fā)育，而在生肌決定因子Myf5和MyoD的早期激活中則具有重要的誘導功能[8-9]。此外，骨骼肌中存在固定的免疫細胞群，其與骨骼肌的健康發(fā)育密切相關[10]。由此可見，免疫相關基因參與骨骼肌生長發(fā)育并發(fā)揮重要作用，但其在豬骨骼肌發(fā)育過程中的表達模式仍有待研究。

研究表明，肥胖型豬種藍塘豬與瘦肉型豬種長白豬的骨骼肌發(fā)育存在差異[11-12]。因此，研究二者骨骼肌發(fā)育過程中的免疫相關基因表達，有助于為肥胖型豬和瘦肉型豬的骨骼肌發(fā)育差異提供更加全面的信息。本研究通過系統(tǒng)分析藍塘豬和長白豬骨骼肌10個發(fā)育時期的轉錄組數據，探究免疫相關基因在豬骨骼肌發(fā)育過程中的表達規(guī)律及相關生物學功能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗中表達譜數據和差異表達基因分析均來自于已發(fā)表的長白豬和藍塘豬的背最長肌組織相關數據[12-13]。該數據共有10個發(fā)育時期，分別為胚胎期35 d、胚胎期49 d、胚胎期63 d、胚胎期77d、胚胎期91d、生后期2 d、生后期28 d、生后期90 d、生后期120 d及生后期180 d。

本實驗將來自于AmiGO2（http://amigo.geneont-ology.org/amigo）的免疫系統(tǒng)過程（GO:0002376 immune system process）以及GSEA（http://software.broadinstitute.org/gsea）的免疫學特征基因集（immunologic signatures gene set）的基因取交集，得到最終使用的免疫相關基因集。

1.2 數據分析

1.2.1 主成分分析 從藍塘豬和長白豬骨骼肌發(fā)育過程中的表達譜數據中篩選得到免疫相關基因的表達量列表，然后利用主成分分析對骨骼肌發(fā)育過程中10個時間點的免疫相關基因和其他基因表達譜進行比較[14]。

1.2.2 差異表達分析 本研究使用edger R語言包鑒定骨骼肌發(fā)育過程中相鄰時間點之間以及各個時間點品種間的差異表達基因[15]，設定差異表達的閾值為|log2FC|≥1且FDR＜ 0.01，并在此基礎上篩選出差異表達的免疫相關基因。

1.2.3 基因集富集分析 選取骨骼肌發(fā)育過程中品種間差異表達免疫相關基因最多的2個時間點，運用GSEA軟件分別對2個時間點不同品種的基因表達譜進行分析，觀察2個時間點的品種間差異表達免疫相關基因在藍塘豬和長白豬骨骼肌的表達情況。

1.2.4 功能注釋分析 選取豬骨骼肌發(fā)育過程中品種間差異表達免疫相關基因數目最多的2個時間點，運用DAVID 分別對2個時間點的品種間差異表達免疫相關基因進行GO功能聚類分析，閾值為P＜0.05。

2 結 果

2.1 藍塘豬與長白豬骨骼肌發(fā)育過程免疫相關基因表達數目統(tǒng)計 本研究所使用的免疫相關基因來自于AmiGO2以及GSEA 2個數據庫，其中在AmiGO2的免疫系統(tǒng)過程（GO:0002376）中包含有3 030個人類基因， GSEA的免疫學特征基因集中包含有多個物種的20 652個基因。為了得到更為準確的免疫相關基因，將2個數據庫中的免疫相關基因進行取交集，最終得到2 680個基因（圖1）。

圖1 免疫相關基因集篩選（A）及其在豬骨骼肌中的表達比例（B）

進一步分析顯示，在藍塘豬和長白豬骨骼肌發(fā)育過程表達的17 261個基因中，有1 129個基因屬于上述的2 680個免疫相關基因（圖1）。各時間點免疫相關基因數目統(tǒng)計結果顯示，豬骨骼肌在胚胎期表達的免疫相關基因數目多于生后期，且在骨骼肌發(fā)育過程中免疫相關基因的表達數目呈下降趨勢（圖2）。

圖2 豬骨骼肌發(fā)育過程各時期表達的免疫相關基因數目

2.2 免疫相關基因在骨骼肌中的表達量分布特征 采用主成分分析方法對豬骨骼肌發(fā)育過程中10個時期的表達量數據進行分析，結果顯示第一主成分和第二主成分的貢獻率總和為92%，說明第一和第二主成分能夠較好地解釋基因表達量的總體分布。進一步比較免疫相關基因及其他基因的第一主成分和第二主成分的分布顯示，二者分布相似，說明免疫相關基因在豬骨骼肌中的表達量水平與其他基因無明顯差異（圖3）。

圖3 免疫相關基因和其他基因表達量主成分分析

2.3 骨骼肌發(fā)育過程中相鄰時間點差異表達免疫相關基因鑒定 統(tǒng)計結果顯示，在豬骨骼肌組織中胚胎期35 d和胚胎期49 d、胚胎期91 d和生后期2 d這2組相鄰時間點之間的差異表達免疫相關基因數目最多，分別為145個和193個（圖4）。骨骼肌發(fā)育過程中每2個相鄰時間點的差異表達免疫相關基因的數量及上下調情況如表1所示。

圖4 相鄰時間點差異表達免疫相關基因數目變化趨勢

表1 相鄰時間點差異表達免疫相關基因數目統(tǒng)計

2.4 藍塘豬和長白豬骨骼肌發(fā)育過程中品種間差異表達免疫相關基因數目 如圖5顯示，骨骼肌10個發(fā)育時間點中品種間差異表達免疫相關基因最多的時間點是胚胎期49 d、生后期180 d，兩者基因數目分別為149、170個。

圖5 品種間差異表達免疫相關基因數目

2.5 基因富集分析結果 結果顯示，2個時間點的差異表達免疫相關基因顯著富集在藍塘豬骨骼肌的高表達區(qū)域（圖6），說明在胚胎期49 d和生后期180 d的品種間差異表達免疫相關基因趨于在藍塘豬骨骼肌中上調表達。

圖6 基因富集分析結果

2.6 品種間差異表達免疫相關基因功能注釋分析 對藍塘豬和長白豬骨骼肌發(fā)育過程中胚胎期49 d及生后期180 d的品種間差異表達免疫相關基因進行功能注釋分析。將顯著富集的GO生物學過程按P值排序，結果顯示在排名前20的GO生物過程中，與免疫功能相關的GO分類有T細胞受體信號通路、Fc-ε受體信號傳導途徑、血管內皮生長因子受體信號通路、NIK / NF-κB信號傳導及凋亡過程的負調控等（表2、表3）。此外，還存在mRNA穩(wěn)定性的調節(jié)、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、MAPK級聯(lián)等與基礎生命活動相關的GO過程。

表2 P值排名前20的免疫相關GO條目（胚胎期49 d）

表3 P值排名前20的免疫相關GO條目（生后期180 d）

3 討 論

3.1 免疫相關基因在豬骨骼肌發(fā)育過程中的表達 多項研究表明免疫相關基因的表達在骨骼肌發(fā)育中發(fā)揮著重要的調控作用。目前，關于免疫相關基因在骨骼肌生理、病理狀態(tài)下的具體調控功能研究已有很多，其在豬骨骼肌生長發(fā)育過程中的表達模式及不同品種豬間的差異表達卻鮮有報道。因此，本研究對藍塘豬和長白豬骨骼肌10個發(fā)育時間點的免疫相關基因進行統(tǒng)計以及差異表達分析，發(fā)現(xiàn)免疫相關基因在豬骨骼肌的不同發(fā)育時期中都存在表達，且表達量水平與其他基因相比無明顯差異，這進一步證明了免疫相關基因在豬骨骼肌組織中表達并參與骨骼肌發(fā)育的調控。

差異表達分析表明，品種間差異表達的免疫相關基因數目最多的時間點是胚胎期49 d以及生后期180 d。GSEA富集分析結果顯示，2個時期的品種間差異表達免疫相關基因趨向于在藍塘豬中上調表達。進一步的功能注釋分析結果顯示，這些差異表達基因富集在免疫應答相關的生物學過程中?；诒狙芯克x實驗動物全部為健康狀態(tài)，推測這些免疫相關基因在骨骼肌正常發(fā)育中發(fā)揮著重要的調控作用。

3.2 胚胎期品種間差異表達免疫相關基因可能與品種間肌纖維發(fā)育差異有關 在胚胎期階段，藍塘豬與長白豬肌肉發(fā)育存在差異。與本研究配套的組織切片結果顯示，2個品種的骨骼肌在胚胎期49 d之前初級肌纖維形成階段，長白豬的初級肌纖維形成時間要晚于藍塘豬，而到胚胎期49 d時2個品種的初級肌纖維的橫截面積均明顯增大，隨后次級肌纖維開始形成，且長白豬的次級肌纖維數目多于藍塘豬[12]，這表明胚胎期49 d前后是長白豬和藍塘豬的胚胎期骨骼肌發(fā)育差異的重要階段。本研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎期品種間差異表達免疫相關基因數量最多的時間點同樣是49 d，功能注釋分析結果顯示這些差異表達基因在NIK/ NF-κB信號傳導顯著富集。研究表明，該生物學過程可以參與細胞凋亡的調控[16]。而多細胞生物的組織分化、器官發(fā)育、機體穩(wěn)態(tài)維持都與細胞凋亡密切相關[17]，其中骨骼肌細胞凋亡是維持骨骼肌正常生長發(fā)育的重要生理活動，對肌細胞的數目起著重要的調節(jié)作用。有研究表明，人類胎兒肌纖維發(fā)育早期，40%以上的肌細胞是通過細胞凋亡清除的[18]。本研究結果表明，在胚胎期49 d藍塘豬和長白豬骨骼肌組織中免疫相關基因的差異表達可能與該時間點前后2個品種間肌纖維發(fā)育的差異有關。

3.3 生后期品種間差異表達免疫相關基因可能與肌纖維生長速度和脂肪異位沉積有關 在生后期階段，藍塘豬和長白豬差異表達免疫相關基因數目最多的時間點發(fā)生在生后期180 d，涉及的生物學過程除了NIK/NF-κB信號傳導，還包括凋亡過程的負調控。在健康狀況良好的情況下，機體細胞的凋亡與生長是相互協(xié)調的[17]。與本研究數據對應的骨骼肌組織切片顯示，在整個生后期長白豬的肌纖維生長都快于藍塘豬，橫截面積也較藍塘豬大[12]。豬在出生后肌纖維數目將不再增加，骨骼肌的生長主要依賴于肌肉細胞的肥大[19]，到180 d時豬骨骼肌的發(fā)育已經基本完成[12]，此時則需要維持骨骼肌的凋亡與生長平衡。長白豬出生后早期的肌纖維生長發(fā)育速度明顯快于藍塘豬，且到180 d時2個品種的組織切片存在明顯差異，這可能與細胞凋亡相關基因在2個品種間的差異表達有關。

除上述富集在與細胞凋亡相關的生物學過程中，生后期180 d的品種間差異表達免疫基因還涉及血管內皮生長因子受體信號通路，這些基因在藍塘豬骨骼肌中全部上調表達，其中CDC42可以促進血管內皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）發(fā)揮作用[20]，Nck1、Fyn則可以形成復合物與VEGF受體結合促進內皮細胞的遷移[21]。已有研究表明，VEGF的亞型VEGF-B在骨骼肌組織中高表達，并且主要在以氧化代謝的慢肌中表達，同時參與骨骼肌脂質代謝，屬于肌肉因子的重要成員，VEFG-B能與內皮細胞表面受體結合，并顯著刺激脂肪酸的轉運，參與脂肪在骨骼肌部位的異位沉積[22]。以上結果說明，在藍塘豬骨骼肌中VEGF-B與內皮細胞受體共同介導的脂肪沉積的這一生理活動與長白豬相比可能較為活躍。

4 結 論

本實驗采用差異表達分析發(fā)現(xiàn)，在胚胎期49 d以及生后期180 d這2個時間點的品種差異表達免疫相關基因數目最多，并且這些基因參與了NF-κB信號傳導和凋亡過程的負調控等與細胞凋亡相關的生物學過程。