寸靜宇，劉秋月，王翔宇，狄 冉，胡文萍，張效生，張金龍，趙永聚，儲明星*

（1.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農業(yè)部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193；

2.西南大學動物科技學院，重慶 400715；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

產羔性狀是綿羊的重要經濟性狀之一。對于綿羊而言，提高每胎的產羔數(shù)是提升生產經濟效益的重要措施[1]。許多研究表明，雌性動物繁殖性能主要受下丘腦-垂體-卵巢軸（Hypothalamic-Pituitary-Ovarian Axis，HPOA）的調控，HPOA的相關基因是研究動物繁殖性狀的重要候選基因。

促卵泡激素（FSH）和促黃體素（LH）都是糖蛋白類促性腺激素，是控制哺乳動物生殖的核心激素，由垂體前葉嗜堿性細胞合成和分泌[2]，它們由α和β2個亞基組成。FSH主要刺激卵泡的生長發(fā)育，且在LH的協(xié)同作用下，激發(fā)卵泡成熟，誘發(fā)排卵[3]，同時在下丘腦-垂體-性腺軸中起重要作用。LH可與FSH協(xié)同促使卵泡排卵，排卵后在LH作用下顆粒細胞轉變?yōu)辄S體細胞，促進類固醇激素合成和分泌[4]。劉建斌等[5]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHβ基因可能是影響小尾寒羊高繁殖性能的一個主效基因。Zi等[6]報道，發(fā)情期高繁殖力樂至黑山羊腦垂體中FSHβ基因的mRNA表達量顯著高于低繁殖力藏山羊。Kumar[7]通過建立LHβ基因敲除小鼠模型證明了該基因對哺乳動物繁殖性能有一定的影響。Nivet等[8]實驗表明，LHβ缺乏可能引發(fā)牛卵泡的早期閉鎖、腫瘤蛋白P53和轉化生長因子b1這類閉鎖劑的上調和生長支持的抑制。

鑒于此，本實驗使用Taqman探針法對小尾寒羊群體FecB基因進行分型，經過連續(xù)觀察并記錄產羔數(shù)和黃體數(shù)（產羔數(shù)和黃體數(shù)均≥2，則定義為多羔），確定了小尾寒羊FecB基因突變++型中產單羔和產多羔的個體，并以此為研究對象，使用實時熒光定量PCR技術檢測FSHβ和LHβ基因在生殖軸相關組織中的表達情況，試圖在排除FecB主效基因的影響后找出FSHβ和LHβ基因和小尾寒羊產羔性能的關系，為小尾寒羊多羔性狀的機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品及主要試劑 隨機選取2～3周歲健康狀況良好的小尾寒羊母羊6只（FecB ++型單羔和多羔各3只），飼養(yǎng)于天津市畜牧獸醫(yī)研究所試驗羊場。用孕酮陰道栓（CIDR）對6只小尾寒羊進行處理，12 d后撤栓，在撤栓后45 h左右屠宰并立即采集大腦、小腦、下丘腦、卵巢、子宮、輸卵管、垂體7種組織，液氮中保存，轉移到-80 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司（北京），反轉錄試劑盒（PrimeScriptTMRT Reagent Kit）和熒光定量染料（SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ）均購于TaKaRa公司（大連）。

1.2 RNA提取 用Trizol 和RNAprep pure動物組織總RNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取上述組織總RNA。利用Nanodrop 2000檢測所提取的總RNA濃度和OD值，并用1.5%的瓊脂糖凝膠對RNA進行電泳檢測，置于-80 冷凍備用。

1.3 cDNA合成 利用反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA，反轉錄體系總體積為20 μL：PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL，Oligo dT Primer 1.0 μL，Random 6 mers 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer（for Real Time）4.0 μL，RNA 1.0 μg，RNase-Free ddH2O 補足至總體積為 20 μL。反轉錄反應條件：37 15 min，85 5 s，獲得cDNA第一鏈。全程在冰上操作。反轉錄產物進行5倍稀釋，用持家基因β-actin進行PCR檢測，可成功擴增。將符合標準的cDNA置于-20 保存，以用于檢測目的基因的表達。

1.4 定量引物設計 根據(jù)GenBank提供的綿羊FSHβ和LHβ基因mRNA序列（登錄號分別為NM_001009798.1、NM_001009380.1），利用Primer Premier 6.0軟件進行跨外顯子引物設計，以β-actin（NM_001009784.2）作為內參基因。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。引物名稱和序列以及擴增片段大小見表1。

1.5 實時熒光定量PCR 熒光定量檢測利用Roche Light Cycler?480Ⅱ 型熒光定量 PCR 儀進行，以β-actin基因為內參基因，每個樣品重復檢測3次。反應體系總 體 積 為 20 μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL， 上、下游引物各 0.8 μL，cDNA 模板 2.0 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL。PCR 程序：95 預變性5 s，95 變性10 s，60 30 s，40個循環(huán)；反應結束后對熔解曲線進行分析。

表1 熒光定量引物信息

1.6 統(tǒng)計分析 采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量，數(shù)據(jù)差異顯著性用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析，組間比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），用最小顯著差異法（LSD）進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取與cDNA合成 使用動物組織總RNA提取試劑盒提取小尾寒羊各組織的RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明，電泳條帶明亮清晰、整齊、無拖尾（圖1），說明所提取的小尾寒羊各組織的RNA完整度好，且無降解和污染；以反轉錄之后的cDNA為模板對β-actin進行sqRT-PCR擴增，設計的β-actin引物擴增效果良好（圖2），目的片段與預期的97 bp一致，且條帶單一，反轉錄之后的cDNA可以用于后續(xù)的熒光定量實驗。

圖 1 RNA電泳檢測

2.2 綿羊FSHβ基因在小尾寒羊（多羔和單羔）繁殖相關組織中的表達 如圖3所示，F(xiàn)SHβ基因主要集中在小尾寒羊下丘腦、卵巢、輸卵管、子宮等組織中表達。在小尾寒羊多羔群體中，F(xiàn)SHβ基因在下丘腦、卵巢、輸卵管、子宮、垂體、小腦、大腦組織表達量均高于單羔群體，其中下丘腦、卵巢、輸卵管、子宮、垂體差異極顯著（P＜0.01）。

圖2 cDNA檢測

圖 3 FSHβ基因在小尾寒羊的組織表達

2.3 綿羊LHβ基因在小尾寒羊（多羔和單羔）繁殖相關組織中的表達 如圖4所示，LHβ基因在小尾寒羊垂體、下丘腦、輸卵管組織高表達，在子宮、卵巢、小腦、大腦組織低表達。在小尾寒羊多羔群體中，LHβ基因在垂體、下丘腦、輸卵管、子宮、卵巢組織表達量均極顯著高于單羔群體（P＜0.01）。

圖 4 LHβ基因在小尾寒羊的組織表達

3 討 論

3.1FSHβ基因表達與動物繁殖 已知FSHβ主要調節(jié)卵泡的增殖和分化[9]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHβ可促進老鼠[10]和綿羊[11]的卵巢發(fā)育、卵泡形成以及增強FSHR mRNA和蛋白在卵巢中的表達。本研究結果顯示，F(xiàn)SHβ在垂體、子宮、輸卵管、卵巢和下丘腦中表達量較高，其次在大腦和小腦中表達，與FSHβ在二花臉和杜洛克豬[12]、家兔[13]、梅山豬[14]的表達結果相一致。本研究也發(fā)現(xiàn)，在小尾寒羊多羔群體中FSHβ基因在下丘腦、卵巢、子宮、輸卵管、垂體組織中的表達量均極顯著高于單羔群體。國內外研究者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHβ的表達在高產的興國灰鵝的輸卵管[15]和山羊的垂體和卵巢組織中[5-6]高于低產動物，與本實驗結果一致。本研究結果顯示，F(xiàn)SHβ在下丘腦組織高表達，與Wei 等[10]研究結果相一致，推測FSHβ可能在腦組織中參與和調控性激素的合成和代謝過程，同時也可能對腦組織的某些功能起調節(jié)作用。還有研究表明，F(xiàn)SHβ不僅只在雌性動物中表達，它也在雄性動物的繁殖相關組織中表達。產舒恒等[16]研究顯示，F(xiàn)SHβ在梅山公豬的HPT軸的組織中也有表達，說明FSHβ基因不僅對雌性動物的繁殖性能有作用，也對雄性動物精子的發(fā)育與成熟有一定作用。FSHβ基因在小尾寒羊單、多羔群體大腦、小腦、垂體、子宮、輸卵管、卵巢和下丘腦的組織均有表達，提示FSHβ可能在小尾寒羊發(fā)情或者排卵的過程中起著重要作用，但具體機制有待繼續(xù)研究。

3.2LHβ基因表達與動物繁殖LHβ在繁殖過程中扮演一個關鍵的角色，它調控卵母細胞的發(fā)育成熟、排卵、受精和黃體的發(fā)育。Nivet等[8]的研究表明，LH缺乏可能引發(fā)牛卵泡的早期閉鎖，說明了LHβ在卵巢發(fā)育中的重要作用。LHβ的作用必須與細胞膜上的特異性受體LHR結合，通過受體介導把生物信息傳遞到靶細胞內，才能發(fā)揮正常的生物學功能。因此，國內外對LHβ基因的研究相對較少。本研究發(fā)現(xiàn)，LHβ基因在小尾寒羊垂體、下丘腦、輸卵管、大腦、小腦、卵巢、子宮7種組織中均有表達，其中在垂體、下丘腦、輸卵管組織中表達量較高，在大腦、小腦、卵巢、子宮組織低表達。吳國平[17]和史紅軍等[18]檢測到LHβ分別在浙東白鵝[17]和藏羊[18]的垂體組織中都有表達，這與本研究發(fā)現(xiàn)的LHβ在小尾寒羊的垂體組織中高表達相一致。另外，LH是由垂體合成分泌后經血液運輸作用在 LHR，推測其與小尾寒羊多羔性能有一定關聯(lián)。本研究也發(fā)現(xiàn)，在小尾寒羊多羔群體中LH基因在下丘腦、卵巢、子宮、輸卵管、垂體、小腦、大腦組織表達量均極顯著高于單羔群體。推測小尾寒羊的產羔性能受到LHβ的調控。

4 結 論

本研究通過實時熒光定量技術檢測發(fā)現(xiàn)FSHβ和LHβ基因在小尾寒羊下丘腦-垂體-卵巢軸組織均有表達。FSHβ在小尾寒羊下丘腦高表達，LHβ在小尾寒羊垂體高表達。FSHβ和LHβ基因在小尾寒羊多羔群體的繁殖相關組織表達量均極顯著高于單羔群體，推測FSHβ和LHβ在小尾寒羊多羔繁殖性狀的調節(jié)過程中可能起到一定作用。