張夢(mèng)陽 張光霽 樓招歡

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 311400

丹參二萜醌(DT)是從中藥丹參（唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge根）中經(jīng)超臨界萃取、高速逆流色譜純化而得富含隱丹參酮和丹參酮ⅡA的有效部位[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)DT具有良好的抗肺癌作用，可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡[2]，但其抗肺癌作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。研究發(fā)現(xiàn)很多癌癥發(fā)生在感染、慢性刺激和炎癥部位，雖然炎癥與腫瘤發(fā)生之間的機(jī)制尚不十分明確，但炎癥微環(huán)境對(duì)于腫瘤發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要[3]。本文擬通過觀察丹參二萜醌對(duì)肺癌荷瘤裸鼠血清炎癥因子水平等的作用，從腫瘤炎癥微環(huán)境角度，闡述丹參二萜醌抗肺癌作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：分述如下。

1.1.1 細(xì)胞株及動(dòng)物：人肺腺癌PC9細(xì)胞由浙江省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；健康裸鼠，5周齡，雄性，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)碼SCXK（滬）2008-0016；小鼠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心SPF級(jí)小鼠飼養(yǎng)室，溫度22±1℃，濕度50%～70%。于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由攝食、飲水。

1.1.2 藥品與試劑：取丹參二萜醌適量，加入適量吐溫研磨后加純水稀釋成混懸液。TNF-α、IL-6、IL-1β的ELISA試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：SERIESII WATER JACKET CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；SW-II ALB3型超凈工作臺(tái)，上海上凈凈化設(shè)備有限公司；VARIOSKAN FLASH多功能全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；al204電子天平，上海托利多儀器有限公司；MoorFLPI散斑全幀實(shí)時(shí)掃描成像系統(tǒng)，英國Moor公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法：分述如下。

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及接種：取液氮凍存的人肺腺癌PC9細(xì)胞，將凍存管置于37℃的水浴鍋中迅速晃動(dòng)使細(xì)胞溶解，將細(xì)胞及培養(yǎng)液吸入備好的離心管（內(nèi)含5ml備好的10%FBS的DMEM培養(yǎng)液）中，800rpm/min，離心5min，棄上清，加入1ml 10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打細(xì)胞使其均勻，將人肺腺癌PC9細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，放置于飽和濕度、5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。觀察人肺腺癌PC9細(xì)胞的生長狀態(tài)，待細(xì)胞生長至80%～90%時(shí)，加1ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，待其鏡下細(xì)胞形狀變圓，用2ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化，離心速率800rpm，離心5min，棄上清，取1ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打細(xì)胞使其均勻，置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，隔天傳代。收集PC9細(xì)胞，加1ml 10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打細(xì)胞使其均勻，取10μl細(xì)胞懸液，貼著載玻片邊緣注入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞個(gè)數(shù)為2×107/ml的單細(xì)胞懸液后，以0.1ml/只的量注射接種于裸鼠腋部皮下，行體內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥：接種人肺腺癌PC9細(xì)胞后，將裸鼠稱重、編號(hào)，隨機(jī)分為模型對(duì)照組（模型組）、DT低、中、高劑量組（15、30、60mg/kg）和順鉑對(duì)照組（順鉑組）（1mg/kg），每組7只。造模7天后開始灌胃給藥，連續(xù)4周。

1.2.3 一般體征觀察：對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠每3天測1次體重，分組記錄。觀察并記錄各組小鼠的精神、活動(dòng)、毛發(fā)、飲食、大小便、皮膚（包括肛周）等一般情況，對(duì)實(shí)驗(yàn)期間死亡的小鼠進(jìn)行解剖，大體觀察并留取組織學(xué)標(biāo)本。

1.2.4 樣本制備：實(shí)驗(yàn)期末，各組小鼠禁食不禁水12h，稱定體質(zhì)量，游標(biāo)卡尺測量瘤徑；眼后靜脈叢采血，4℃，3500r/min離心15min，分離血清，供炎癥因子檢測用；解剖小鼠，完整剝離瘤塊，稱重，計(jì)算抑瘤率。

1.2.5 血清炎癥因子水平檢測：取上述采集的血清樣本，ELISA法檢測各樣本中TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子水平，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.6 腫瘤組織c-JUN、COX-2蛋白表達(dá)檢測：采用免疫組化法。取上述經(jīng)10%福爾馬林固定的瘤組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片（4μm），免疫組化DAB顯色法（脫蠟→水化→抗原修復(fù)→滅活內(nèi)源性過氧化氫酶→5%BSA封閉→孵育抗c-JUN、COX-2一抗或PBS→孵育二抗→DAB顯色→蘇木素染核→脫水→二甲苯透明→封片→鏡下觀察）觀察瘤組織中c-JUN、COX-2蛋白的表達(dá)，以細(xì)胞內(nèi)有明顯黃色/棕黃色顆粒判定為陽性細(xì)胞；采用image-pro plus5進(jìn)行蛋白表達(dá)分析和統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析多重比較，各數(shù)據(jù)均采用±s表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DT對(duì)荷瘤裸鼠體重及抑瘤率的影響：如表1結(jié)果顯示，各組裸鼠體重?zé)o顯著性差異（P＞0.05）；在抑瘤率上，順鉑和60mg/kg DT較為接近。

表1 各組體重及瘤重比較（±s，n=7）

表1 各組體重及瘤重比較（±s，n=7）

抑瘤率（%）-32.2-14.1-0.3 39.5分 組模型組順鉑組低劑量組中劑量組高劑量組劑量 (mg/kg）-1 1 5 30 60體重（g）25.8±2.3 22.9±2.1 25.4±2.0 25.4±2.2 24.8±1.4

2.2 DT對(duì)荷瘤裸鼠血清炎癥因子及瘤組織c-JUN、COX-2表達(dá)的影響：由表2可見，30mg/kg DT能顯著降低荷瘤模型動(dòng)物血清TNF-a、IL-6水平。60、30mg/kg DT能顯著抑制PC9肺癌移植瘤組織c-JUN和COX-2蛋白表達(dá)，改善腫瘤炎癥微環(huán)境（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1。

表2 各組血清炎癥因子水平比較（±s，n=7）

表2 各組血清炎癥因子水平比較（±s，n=7）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

分組模型組順鉑組低劑量組中劑量組高劑量組IL-1β(pg/ml)14.4±1.2 14.0±1.8 17.0±2.2 13.4±1.0 13.7±2.7劑量（mg/kg）-1 1 5 30 60 TNF-α(pg/ml)87.7±18.9 34.7±2.1**75.1±15.0 52.7±14.6*82.9±28.0 IL-6(pg/ml)19.3±1.6 14.0±2.5**17.3±2.1 11.9±2.2**17.0±3.6

圖1 各組腫瘤組織c-JUN、COX-2蛋白表達(dá)（400×）

3 討論

已知炎癥為惡性腫瘤的第八大生物學(xué)特征，IL-6等炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲過程中發(fā)揮了重要作用，靶向炎癥細(xì)胞因子的抗腫瘤藥物開發(fā)以及亞臨床和臨床研究已是目前腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的一大熱點(diǎn)[4]。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，腫瘤源于“正氣虧虛，毒瘀互結(jié)”脈絡(luò)而成，“癌毒”是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素；“癌毒”病機(jī)理論與腫瘤炎性微環(huán)境密切相關(guān)，癌毒的形成過程及病機(jī)特點(diǎn)與腫瘤炎性微環(huán)境中“炎癥-腫瘤”的轉(zhuǎn)化過程具有相似性?，F(xiàn)代研究表明，肺癌的發(fā)生發(fā)展與吸煙等刺激引起的肺局部持續(xù)炎癥狀態(tài)密切相關(guān)。香煙煙霧中含有的大量自由基可損傷肺泡上皮細(xì)胞，激活I(lǐng)KKβ/NF-κB、JNK通路，使IL-1β、IL-6等炎癥因子大量分泌，促進(jìn)組織局部的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖及細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)活化，引起DNA不可逆損傷，啟動(dòng)細(xì)胞向轉(zhuǎn)移性疾病發(fā)展，促進(jìn)了肺癌的發(fā)生。

研究結(jié)果表明，丹參二萜醌能顯著降低荷瘤模型動(dòng)物血清TNF-a、IL-6水平，抑制PC9肺癌移植瘤組織c-JUN和COX-2蛋白表達(dá)，抑制移植瘤生長。因此，丹參二萜醌能夠祛瘀去毒，抑制炎癥反應(yīng)，改善腫瘤炎癥微環(huán)境，拮抗肺癌的發(fā)生。