盛建輝 黃玉林 田明慶 姜建洋

作者單位：1浙江省衢州市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科（衢州 324000）；2浙江省衢州市柯城區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（衢州 324000）

肺癌是我國目前發(fā)病率與病死率均高居首位的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancers，NSCLC）約占80%，大部分患者初診時(shí)已處于晚期階段，半數(shù)以上患者年齡＞65歲，近1/3患者年齡＞75歲[1]。肺癌的化療療效已進(jìn)入平臺(tái)期，且毒副反應(yīng)嚴(yán)重，老年患者耐受性差[2]。近年來，以表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）為主要靶點(diǎn)的治療是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)，針對(duì)EGFR突變的檢測(cè)，是篩選最合適的NSCLC患者進(jìn)行靶向治療的關(guān)健[3-4]。本研究基于CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢標(biāo)本，通過直接測(cè)序法檢測(cè)老年晚期NSCLC患者的EGFR基因突變類型，統(tǒng)計(jì)分析EGFR基因各種外顯子的突變情況，為晚期非小細(xì)胞肺癌老年患者行靶向治療提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年10月—2017年10月浙江大學(xué)衢州醫(yī)院呼吸內(nèi)科經(jīng)CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢，且病理診斷[5]為非小細(xì)胞肺癌的晚期老年患者45例，均未進(jìn)行過放化療。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本獲取 采用SIEMENS16排螺旋CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺，經(jīng)Doctor Japan Co.Ltd組合式活檢針常規(guī)取材兩份，將其中一份送檢病理科確診為NSCLC后，再將另外一份進(jìn)行DNA提取。

1.2.2 DNA提取 將取到的標(biāo)本進(jìn)行切片處理，制成6個(gè)切片，用石蠟進(jìn)行包埋，烘干，用二甲苯去除石蠟，浸泡于無水乙醇中，取出后用超純水沖洗，最后將組織干燥，應(yīng)用Sigma-Aldrich公司DNA提取試劑盒（批號(hào)20150603）按照說明書進(jìn)行DNA提取，并用安捷倫公司的Cary60紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定提取DNA的含量和純度。

1.2.3 EGFR基因突變檢測(cè) 用ARMS-PCR法進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)，所用儀器為北京雅康博生物科技有限公司生產(chǎn)的人EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒（批號(hào)TB002）和ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，操作步驟按照基因突變檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行，并嚴(yán)格按照說明書確定突變結(jié)果。每次檢測(cè)均設(shè)立陽性質(zhì)控、陰性質(zhì)控、內(nèi)參基因和內(nèi)控基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，基因突變率為該基因突變數(shù)/總標(biāo)本數(shù)，基因突變率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 45例中男22例，女23例；年齡60～80歲，平均（69.80±5.37）歲；平均病程（11.5±3.7）個(gè)月；有吸煙史17例，無吸煙者28例；根據(jù)2015年世界衛(wèi)生組織（WHO）肺腫瘤組織學(xué)分型[6]，鱗癌14例，腺癌31例；根據(jù)2009年IASLA國際肺癌分期[7]，Ⅲ期26例，Ⅳ期19例。

2.2 EGFR基因突變率 45例經(jīng)直接測(cè)序技術(shù)測(cè)序的非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變的共檢測(cè)出17例，總突變率為37.8%（17/45），其中11例存在外顯子19、21復(fù)合突變；外顯子19突變9例，占突變總數(shù)的52.9%（9/17）；外顯子21突變檢出7例，占41.2%（7/17），外顯子19和外顯子21總共占突變數(shù)的94.1%（16/17）。外顯子20有1例突變，占突變總數(shù)5.9%（1/17）。

2.3 EGFR基因突變類型 EGFR基因外顯子突變類型主要有錯(cuò)義突變、缺失突變、復(fù)制或插入突變等三種構(gòu)成，見表1。

2.3.1 EGFR基因外顯子19突變 外顯子19突變?yōu)樽畛Ｒ姷耐蛔冾愋椭?，主要發(fā)生在密碼子第746～750位的堿基缺失，而導(dǎo)致由它們所編碼的蛋白丟失。共檢測(cè)出6種突變類型：類型1：del E746-A750（1）為外顯子19的最常見突變類型，共檢測(cè)出4例，主要由堿基序列c.2234至2249共16個(gè)堿基缺失，從而導(dǎo)致由密碼子第746～750位所編碼EGFR蛋白所需的氨基酸（ELREA）丟失。類型2：del E746-A750（2）所缺失的15個(gè)堿基主要發(fā)生在堿基序列c.2235至c.2249，但由密碼子編碼的氨基酸丟失與類型 1 相同。類型 3：del E746-A750（3）所缺失的 15 個(gè)堿基較類型3后移一位，但由此堿基丟失引起的氨基酸丟失與類型1相同。類型4：del E746-A751所缺失16個(gè)堿基發(fā)生在堿基序列c.2236至c.2251，相應(yīng)的密碼子第746～751位所編碼的氨基酸（ELREAT）丟失。類型 5：del L747-P753ins S 所缺失的18個(gè)堿基序列發(fā)生在堿基序列c.2240至c.2257，從而導(dǎo)致密碼子第 747～753位所編碼的氨基酸（LREATSP）丟失，同時(shí)由密碼子753所編碼的脯氨酸（Pro）由新引入的絲氨酸（Ser）所替代。類型 6：del E746-A750ins P所缺失9個(gè)堿基發(fā)生在堿基序列c.2236到c.2244，從而導(dǎo)致由它們所編碼的氨基酸（ELR）丟失。同時(shí)，堿基序列c.2248G突變成C，密碼子GCA被CCA取代，相應(yīng)編碼的丙氨酸（Ala）錯(cuò)義為脯氨酸（Pro）。

表1 45例老年晚期非小細(xì)胞肺癌表皮生長因子受體基因突變類型

2.3.2 EGFR基因外顯子20突變 EGFR基因外顯子20突變，即S768I是由堿基序列c.2303G突變?yōu)門，第768位密碼子AGC轉(zhuǎn)變成ATC，由它所編碼的絲氨酸（Ser）被異亮氨酸（Ile）替代。

2.3.3 EGFR基因外顯子21突變 外顯子21突變是EGFR基因突變的主要類型之一，均由堿基點(diǎn)錯(cuò)義突變引起，共檢測(cè)出3種突變類型，詳述如下：類型1：L858R突變占絕大部分，共檢測(cè)出5例。突變發(fā)生在堿基序列c.2573T錯(cuò)義成G，而第858位的密碼子CTG轉(zhuǎn)變成CGG，所編碼的亮氨酸（Leu）被精氨酸（Arg）替代。類型2：P848L突變發(fā)生在堿基序列c.2543C錯(cuò)義為T，相應(yīng)的第848位密碼子CCG變?yōu)镃TG，而由密碼子所編碼的脯氨酸（Pro）替代成亮氨酸（Leu）。類型3：L861Q突變是發(fā)生在堿基序列c.2582T錯(cuò)義為A，以致第861位密碼子由CTG轉(zhuǎn)變?yōu)镃AG，相應(yīng)編碼的亮氨酸（Leu）被谷氨酰胺（Gln）所替代。

2.4 EGFR突變與性別、吸煙情況、病理類型及肺癌分期之間的關(guān)系 45例老年晚期非小細(xì)胞肺癌患者中，男女兩組EGFR基因突變率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。吸煙組與非吸煙組突變發(fā)生率相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。鱗癌與腺癌兩種病理類型組間突變發(fā)生率相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。肺癌分期組間突變發(fā)生率相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 2。

表2 45例老年晚期非小細(xì)胞肺癌表皮生長因子受體突變與性別、吸煙情況、病理類型及肺癌分期相關(guān)性

3 討論

EGFR基因位于人類第七號(hào)常染體短臂上（7P12），由28個(gè)外顯子組成，其編碼的EGFR是一種將胞外信號(hào)傳遞至胞內(nèi)的、并具有酪氨酸激酶活性重要途徑的跨膜糖蛋白；調(diào)控著腫瘤組織細(xì)胞的增殖、分化、血管生成及凋亡抑制等機(jī)制，從而與惡性腫瘤的生長、侵襲，以及轉(zhuǎn)移等有著密切聯(lián)系[8-9]。目前，對(duì)惡性腫瘤以EGFR為主要靶點(diǎn)的分子靶向治療已成為研究熱點(diǎn)，越來越受國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界所關(guān)注，而其中以肺癌靶向藥小分子表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）， 如吉 非 替 尼（Gefitinib）為代表，通過與ATP競(jìng)爭結(jié)合胞內(nèi)EGFR-TK結(jié)構(gòu)域的ATP位點(diǎn)，從而抑制下游通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以阻斷腫瘤細(xì)胞的生長[10]。EGFR-TKI藥物具有高度選擇性、安全性高、耐受性極好、毒副反應(yīng)輕微等優(yōu)點(diǎn)，并已在臨床上較為廣泛應(yīng)用。

然而，EGFR-TKI類藥物價(jià)格昂貴且總體療效不高，Gefitinib對(duì)于我國人群的客觀緩解率只有35.5%，而這部分患者在臨床上的特征表現(xiàn)為女性、無吸煙史和腺癌[11]。因此，對(duì)于老年晚期非小細(xì)胞肺癌患者，不能耐受化療情況下，選擇合理的治療對(duì)像尤為重要。Lynch等[12]和Paez等[13]學(xué)者在2004年率先報(bào)道了位于EGFR-TK基因編碼區(qū)外顯子18～21的突變類型與Gefitinib的有效率顯著相關(guān)。Mitsudomo等[14]報(bào)道了EGFR-TKI對(duì)外顯子19突變的NSCLC有效率高達(dá)81%，外顯子21突變的有效率為71%，以及外顯子18突變的有效率為56%，從而提示存在以上三種突變類型的NSCLC均對(duì)EGFR-TKI敏感。然而，關(guān)于外顯子20突變，據(jù)有關(guān)學(xué)者研究顯示，NSCLC存在TKI獲得性耐藥[15]。所以，EGFR基因突變，是EGFR-TKI對(duì)NSCLC敏感的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子，從而臨床上通過對(duì)EGFR基因突變的檢測(cè)，可以篩選出最合適的患者進(jìn)行分子靶向治療，以提高EGFRTKI對(duì)NSCLC的療效[16-17]。

研究發(fā)現(xiàn)，到目前為止，90%以上的EGFR基因突變集中于外顯子18～21區(qū)，其中，外顯子19缺失突變約占突變總數(shù)的48%，外顯子21點(diǎn)突變占43%[14]。歐美等國NSCLC的總體突變率較低，東亞人群的突變率較高，我國EGFR基因的突變率約為34.0%，與TKI治療NSCLC的我國總體人群的客觀緩解率基本相符合，突變主要發(fā)生在外顯子19與21，其檢出率分別為18.5%、13.7%，而外顯子20突變少見，約占1.8%[18]。

本研究顯示，45例肺癌組織中，EGFR基因的總體突變率為37.8%，這與近期我國大樣本研究的EGFR突變率相符合[19]。其中，外顯子19和21突變占突變總數(shù)的94.1%，其突變的主要類型為外顯子19的del E746-A750與外顯子21的L858R，其突變類型以外顯子21為主（外顯子19突變占52.9%，外顯子21占41.2%），與Mitsudomo等[14]報(bào)道相符合。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，老年晚期NSCLC的EGFR基因突變女性（52.2%）多于男性（22.7%），非吸煙患者（46.9%）多于吸煙患者（15.4%），腺癌（48.4%）多于鱗癌（14.2%），兩兩之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而基因突變與肺癌分期無關(guān)，兩者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。根據(jù)本研究結(jié)果可知，EGFR基因突變的特點(diǎn)主要與性別、是否吸煙及病理類型相關(guān)，大部分突變是女性、非吸煙、腺癌患者，這與臨床上經(jīng)EGFR-TKI治療有效患者的特征相吻合。

因此，對(duì)于老年晚期非小細(xì)胞肺癌，制定真正有效的個(gè)體治療方案，選擇最合適的人群是進(jìn)行特異性分子靶向治療的關(guān)健。