來岳標(biāo) 姚慶華

順鉑是肺癌化療的基礎(chǔ)藥物，但是其有效率往往隨著腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生而逐步降低，甚至無效，腫瘤細(xì)胞對順鉑的耐藥嚴(yán)重影響了化療療效[1]。川芎嗪（tetramethypyrazine，TMP）是中藥川芎的有效成分，具有抗血小板聚集、改善血流動力學(xué)、增強(qiáng)免疫力、清除氧自由基及改善纖維化等作用。已有研究證實，川芎嗪具有抗腫瘤生長、抗血管生成、抗細(xì)胞耐藥、放療增敏、抑制腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移等作用，但對于川芎嗪逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對化療藥物耐藥性的研究尚處于起步階段[2-3]。研究表明，川芎嗪能在細(xì)胞層面誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，但其對川芎嗪誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制研究仍不夠深入[4]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路對基因的表達(dá)及細(xì)胞質(zhì)功能的正常發(fā)揮起著關(guān)鍵的作用，并廣泛參與細(xì)胞凋亡，其信號通路的二級結(jié)構(gòu)主要由應(yīng)激活化蛋白激酶（JNK）、p38蛋白激酶、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）三個部分相互交叉連接組成[5]。本研究從分子水平探討川芎嗪誘導(dǎo)順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP的凋亡機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 實驗所用耐藥細(xì)胞株A549/DDP由浙江省腫瘤醫(yī)院實驗室提供。肺腺癌A549/DDP細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃且含5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，1:4～1:5比率傳代。

1.2 藥 物 川芎嗪（四甲基吡嗪）注射液：規(guī)格80mg/支，批號20150552，由北京四環(huán)科寶制藥有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑及儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基（批號 30030）、胎牛血清（批號 11012）、緩沖液（批號 C0221A）、消化液（批號 C0201）、培養(yǎng)皿（批號 FCD101）等購于碧云天生物有限公司。顯微鏡（XSP-2C）、流式細(xì)胞儀（FACSCanto）、放射自顯影儀（DC-400SL）等儀器由浙江省腫瘤醫(yī)院實驗室提供。

2 方法

2.1 MTT法測定不同濃度川芎嗪對A549/DDP細(xì)胞增殖抑制率的影響 細(xì)胞傳代3次后收集A549/DDP細(xì)胞，洗滌沉淀后用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至7×104個/mL，用移液器將細(xì)胞懸液加至96孔板，每孔200μL。12h后顯微鏡下仔細(xì)觀察并確認(rèn)細(xì)胞貼壁后用培養(yǎng)基調(diào)整川芎嗪濃度（0.10、0.20、0.40、0.80、1.00mg/mL），將不同濃度TMP分別加入96孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)孵育，空白對照組加入RPMI-1640培養(yǎng)基。在加入藥物24h、48h、72h后分別加入20μL噻唑藍(lán)（MTT）溶液終止細(xì)胞增殖，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育A549/DDP細(xì)胞4h后用移液器小心吸棄96孔板內(nèi)的液體；二甲基亞砜150μL均勻加入96孔板后將其置于振蕩器上緩慢勻速振蕩10min。振蕩結(jié)束后將96孔板置于酶標(biāo)儀中及時測定每孔吸光值，將吸光值轉(zhuǎn)換為A549/DDP細(xì)胞增殖抑制率。然后根據(jù)不同濃度川芎嗪所對應(yīng)的A549/DDP細(xì)胞增殖抑制率繪制曲線圖。每一濃度均設(shè)置6個平行對照孔，實驗3次以上。

2.2 流式細(xì)胞法測定川芎嗪對肺腺癌A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期的A549/DDP細(xì)胞每孔10×105個/mL接種于培養(yǎng)皿中，24h后實驗組加入濃度為 0.20mg·mL-1、0.40mg·mL-1、0.80mg·mL-1的川芎嗪，對照組不加藥物。不同濃度川芎嗪加入后繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育72h后離心、洗滌、收集A549/DDP細(xì)胞。用培養(yǎng)基調(diào)整濃度為2×106/mL。各組取1mL細(xì)胞懸液后，在4℃、800rmp條件下離心12min，移棄上清液。PBS液提前預(yù)冷至4℃，將A549/DDP細(xì)胞洗滌3次后用培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整至2×106個/mL。將細(xì)胞懸液移至流式管后加入細(xì)胞結(jié)合緩沖液，細(xì)胞懸液與細(xì)胞結(jié)合緩沖液充分接觸后再加入細(xì)胞染色液后，將流式管放置于0℃避光條件下繼續(xù)孵育15min。孵育結(jié)束后將流式管置于流式細(xì)胞儀內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞凋亡相關(guān)數(shù)據(jù)采集并分析結(jié)果。

2.3 川芎嗪對肺腺癌A549/DDP細(xì)胞形態(tài)的影響取A549/DDP細(xì)胞每孔1×105個/mL接種于六孔板中，12h后確認(rèn)細(xì)胞貼壁，實驗組A549/DDP細(xì)胞用濃度為0.40mg/mL的川芎嗪處理72h進(jìn)行干預(yù)，對照組加入等量培養(yǎng)基。72h后離心、洗滌、收集細(xì)胞后加入2.5%的戊二醛溶液中在4℃避光條件下固定4h，固定結(jié)束后用乙醇溶液進(jìn)行細(xì)胞脫水處理，分別予丙酮及環(huán)氧樹脂處理并包埋2h，將包埋后的標(biāo)本放置于62℃烤箱中烘烤后結(jié)束后進(jìn)行標(biāo)本超薄切片處理；運(yùn)用透射電子顯微鏡仔細(xì)觀察細(xì)胞處理前后是否有形態(tài)學(xué)及凋亡征象的變化。通過觀察細(xì)胞胞體大小、細(xì)胞質(zhì)濃縮狀態(tài)、細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚情況、細(xì)胞核膜、細(xì)胞質(zhì)膜以及細(xì)胞器完整與否來判斷耐藥細(xì)胞A549/DDP的凋亡。每一濃度均設(shè)置6個平行對照孔，實驗3次以上。

2.4 免疫印跡實驗 取對數(shù)生長期的A549/DDP細(xì)胞，每孔20×105個/mL接種于培養(yǎng)皿中，不同濃度川芎嗪（0.2mg·mL-1、0.4mg·mL-1）處理 A549/DDP 細(xì)胞72h后離心、洗滌、收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS液懸浮細(xì)胞后洗滌2遍，將洗滌干凈后的細(xì)胞加入提前預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中充分接觸，對照組不加藥物。對照組及不同濃度藥物處理組均采用BCA進(jìn)行蛋白濃度測定，并記錄數(shù)據(jù)。采用10%凝膠跑電泳后分離、轉(zhuǎn)膜。用TBST液體在常溫下進(jìn)行抗體封閉。洗膜后于4℃條件下孵育相對應(yīng)的一抗（P-JNK，JNK，PP38，P38，P-ERK，ERK）12h，一抗稀釋濃度均為 1：1000。12h后室溫下漂洗3次后孵育二抗，化學(xué)發(fā)光顯色劑涂勻后，于自顯影儀中曝光并收集數(shù)據(jù)。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 本實驗均在相同實驗條件下進(jìn)行3次及以上實驗。應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 川芎嗪抑制肺癌細(xì)胞A549/DDP的增殖 川芎嗪對A549/DDP細(xì)胞的增殖抑制率隨著川芎嗪濃度的增加和作用時間的延長而逐漸增加，有時間和劑量依賴性（P＜0.05）。川芎嗪作用72h A549/DDP細(xì)胞在增殖抑制率上表現(xiàn)出明顯的梯度，故后續(xù)實驗均選用藥物干預(yù)72h作為實驗條件。見表1。

表1 不同濃度川芎嗪對肺癌A549/DDP細(xì)胞增殖抑制率的影響（%，）

表1 不同濃度川芎嗪對肺癌A549/DDP細(xì)胞增殖抑制率的影響（%，）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與 24h 組比較，△P＜0.05；與 48h 組比較，▲P＜0.05；TMP：川芎嗪

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3.2 川芎嗪誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549/DDP的凋亡 川芎嗪（0.20mg·mL-1、0.40mg·mL-1、0.80mg·mL-1）處理耐藥細(xì)胞A549/DDP 72h后，細(xì)胞早期凋亡（AV+/PI-）比例隨著川芎嗪濃度的增加而逐漸增加，并且存在濃度依賴性，見插頁圖1。

表2 MAPK信號通路蛋白表達(dá)灰度值比較（

表2 MAPK信號通路蛋白表達(dá)灰度值比較（

注：與對照組比較，*P＜0.05；與 TMP（0.20mg/mL）比較，△P＜0.05；TMP：川芎嗪；P-ERK：磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶；ERK：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶；P-JNK：磷酸化應(yīng)激活化蛋白激酶；JNK：應(yīng)激活化蛋白激酶；p38：蛋白激酶；P-p38：磷酸化p38蛋白激酶；Action：內(nèi)參蛋白

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3.3 川芎嗪作用前后A549/DDP細(xì)胞形態(tài)變化 川芎嗪處理后A549/DDP細(xì)胞出現(xiàn)了典型的凋亡形態(tài)改變：細(xì)胞核凝聚，呈新月形；細(xì)胞體積縮?。患?xì)胞膜、質(zhì)膜及細(xì)胞器不連續(xù)、完整性消失；胞質(zhì)內(nèi)可見數(shù)量不等、大小不一的空泡出現(xiàn)；典型的凋亡小體出現(xiàn)，見插頁圖2。

3.4 川芎嗪通過MAPK信號通路誘導(dǎo)A549/DDP細(xì)胞的凋亡 P-JNK及P-P38在川芎嗪處理后出現(xiàn)蛋白量表達(dá)量增加的趨勢，而P-ERK出現(xiàn)表達(dá)降低的趨勢；而非磷酸化表達(dá)的ERK、JNK、P38在蛋白水平無明顯變化。通過Western blot檢測表明，在MAPK信號通路中川芎嗪能通過抑制ERK的表達(dá)的同時增加JNK和P-38在蛋白水平的表達(dá)從而誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞株A549/DDP細(xì)胞的凋亡，見表2、插頁圖3。

4 討論

細(xì)胞凋亡是生物體內(nèi)基因控制的一種細(xì)胞死亡過程，其主要目的是通過細(xì)胞凋亡后將細(xì)胞凋亡產(chǎn)物進(jìn)行重新利用，維持體內(nèi)代謝的需要，是一種主動的損傷現(xiàn)象，是細(xì)胞為了適應(yīng)環(huán)境的變化而主動死亡的一個過程，細(xì)胞凋亡對于腫瘤的產(chǎn)生及生長過程具有十分重要的意義[6-8]。

本研究顯示，川芎嗪與細(xì)胞增殖率之間存在時間劑量依賴性（P＜0.05），川芎嗪作用72小時后A549/DDP細(xì)胞在增殖抑制率上表現(xiàn)出明顯的梯度。V-PI染色法檢測顯示川芎嗪處理A519/DDP細(xì)胞后，早期凋亡率隨著川芎嗪濃度的增加而逐漸增加，說明川芎嗪誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是殺傷A549/DDP細(xì)胞的途徑之一。電子顯微鏡觀察可見川芎嗪0.40mg·mL-1處理后A549/DDP細(xì)胞細(xì)胞核凝聚，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞膜、質(zhì)膜及細(xì)胞器不連續(xù)，完整性消失，胞質(zhì)內(nèi)可見數(shù)量不等、大小不一的空泡和典型的凋亡小體出現(xiàn)，直接證明了A549/DDP細(xì)胞的凋亡。

MAPK信號通路涉及多種生物學(xué)行為，具有將細(xì)胞表面的信息傳遞至核內(nèi)進(jìn)而影響基因轉(zhuǎn)錄的重要傳遞途徑，對于腫瘤耐藥細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生發(fā)揮著重要的作用，主要由ERK、JNK和p38組成；ERK參與細(xì)胞的增殖、分化和增殖活性，JNK和p38激酶主要由細(xì)胞外刺激產(chǎn)生應(yīng)答[15]。本實驗表明，川芎嗪處理72小時后P-JNK及p-P38蛋白量表達(dá)增加且呈現(xiàn)出濃度依賴性，而p-ERK出現(xiàn)表達(dá)降低的趨勢（P＜0.05）；而非磷酸化表達(dá)的 ERK、JNK、P-38在蛋白水平未見到有意義的變化。

綜上所述，本研究觀察到川芎嗪能引起順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP的增殖抑制及凋亡，表現(xiàn)出JNK及p-38在磷酸化水平的活化，說明川芎嗪能通過MAPK信號通路引起A549/DDP的凋亡。