盛賢福 王 珺 莊海峰 張 宇 陳均法

復(fù)方苦參注射液（compound kushen injection，CKI）是從苦參和白土苓兩味中藥中經(jīng)提取精制而成的一種中藥注射劑，主要有效成分包括氧化苦參堿、苦參堿、槐定堿、黃酮類等，其功效主要為清熱利濕、涼血解毒、散結(jié)止痛等，一直廣泛應(yīng)用于多種實體腫瘤的輔助治療[1]。研究發(fā)現(xiàn)，CKI除了明顯減輕放化療的副反應(yīng)、改善生存質(zhì)量、減輕癌癥疼痛等功效外，有增強放化療療效、調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境等作用[2]。澳洲阿德萊德大學(xué)的David Adelson研究團隊發(fā)現(xiàn)，CKI能夠改變細胞周期、細胞增殖、細胞凋亡相關(guān)靶基因表達，從而表現(xiàn)出驚人的殺滅腫瘤細胞的療效[3]。關(guān)于CKI在血液腫瘤中應(yīng)用的報道較少，張暖等[4]報道CKI能增強CAG預(yù)激方案[CAG方案，包括阿克拉霉素（aclarubicin）、小劑量阿糖胞苷（cytarabine）和粒細胞集落刺激因子（G-CSF）]在老年急性白血病患者中的化療療效，但其具體機制仍無人涉及。本研究以HL-60細胞為急性髓細胞白血病模型，體外研究CKI能否影響HL-60細胞的遷移能力，并探討其中可能存在的表觀遺傳學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1 材 料 IMDM培養(yǎng)基（杭州吉諾生物有限公司，GNM-1200），胎牛血清（FBS，美國 Gibco，批號10100-147），復(fù)方苦參注射液（Compound Kushen Injection，批號 Z14021231，5mL/支，山西振東制藥股份有限公司），人重組粒細胞集落刺激因子（rhGCSF，批號 201302B06，150μg/支，廈門特寶生物工程股份有限公司），SDF-1α（美國Sigma-Aldrich公司，批號 SRP3253），Trizol（日本 Takara公司，批號A7205-1），反轉(zhuǎn)錄酶（美國Thermo公司，批號EP0441），PCR 試劑盒（qPCR SYBR Green Mix，東盛公司，批號 P2092），兔抗人CXCR4單抗（美國Santa公司，1:1500，批號 sc-9046），鼠抗人 β-Tubulin單抗（天津三箭生物技術(shù)有限公司，1:1500，批號 KM9003），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（美國 Santa公司，1:1500，批號 sc-2004），8μ 孔徑的Trasnwell小室（美國Costar，批號 3422）。

1.2 細胞培養(yǎng) HL-60細胞株由中國科學(xué)院上海細胞研究所饋贈。HL-60用含20%FBS的IMDM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 實驗分組 蛋白質(zhì)印跡和PCR時實驗分以下五組：實驗CKI組（0.5ng/mL）、陽性對照 G-CSF組（40ng/mL）、CKI和G-CSF聯(lián)合加藥組、空白對照組（IMDM培養(yǎng)液），處理48h后收集細胞，離心，棄上清，用于蛋白印跡和PCR實驗。細胞遷移實驗時分以下五組：空白對照組（無SDF-1α）、SDF-1α（100ng/mL） 組、SDF-1α+CKI組、SDF-1α+G-CSF 組和SDF-1α+CKI聯(lián)合G-CSF組。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法 取120μL加樣緩沖液（內(nèi)含蛋白裂解液，蛋白酶抑制劑）于冰上裂解HL-60細胞，12 000r/min、4℃離心1min。取蛋白上清液，BCA法檢測蛋白濃度，溶于加樣緩沖液中100℃煮沸10min，用30%SDS-PAGE電泳。采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素（PVDF）膜，用封閉液（含5%脫脂奶粉的TBST溶液）室溫封閉膜30min。然后放置在相應(yīng)的CXCR4和β-Tubulin一抗中4℃孵育過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育1h。ECL（美國PerkinElmer公司）化學(xué)發(fā)光檢測，自動成像儀（上海天能科技有限公司）成像，凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）分析結(jié)果。

1.5 實時熒光定量PCR 收集各組細胞（約5×105細胞），Trizol法提取總RNA，紫外分析測定所抽提RNA的濃度。取質(zhì)量相等的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)成cDNA，用于后續(xù)PCR。各基因PCR引物及反應(yīng)條件見表1。用實時熒光定量PCR法檢測CXCR4、miRNA-146a及內(nèi)參hATCB在HL-60細胞中的表達量，采用△△Ct法進行各基因表達的相對定量。

1.6 Transwell小室遷移實驗 為減少非特異性遷移及增加HL-60細胞對SDF-1α敏感性，實驗前用無FBS的IMDM饑餓培養(yǎng)液（以0.5%BSA代替）饑餓48h。遷移實驗前用饑餓培養(yǎng)液平衡Transwell小室2h。HL-60細胞經(jīng)處理（CKI、G-CSF或聯(lián)合處理48h）或不做任何處理后，PBS漂洗1次，再用饑餓培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整濃度為5×106/mL。上室加入100μL各組細胞懸液，下室加入600μL含100ng/mL SDF-1α的饑餓培養(yǎng)液（無SDF-1α組只含饑餓培養(yǎng)液），培養(yǎng)條件下孵育3h。收集下室液體，離心，棄上清，0.5mL饑餓培養(yǎng)液重懸。流式細胞儀計數(shù)，在高速通道條件下吸取20s，計數(shù)下室細胞數(shù)。遷移指數(shù)=（有SDF-1α?xí)r遷移至下室細胞數(shù)/無SDF-1α?xí)r遷移至下室細胞數(shù)）。

表1 RT-PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行處理。每個實驗均獨立重復(fù)3次，呈正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組數(shù)據(jù)兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組對HL-60細胞遷移指數(shù)的影響 G-CSF降低細胞CXCR4表達后會動員HSC和中性粒細胞至外周血循環(huán)，在體外實驗中表現(xiàn)為G-CSF處理后細胞向SDF-1α遷移能力下降。HL-60細胞經(jīng)饑餓48h 后，分別予以 0.5ng/mL CKI、40ng/mL G-CSF 或聯(lián)合處理48h，然后用Transwell小室檢測細胞遷移能力變化。結(jié)果如表2所示，SDF-1α明顯促進HL-60細胞的遷移，而CKI、G-CSF單藥或聯(lián)合用藥均能明顯阻斷HL-60細胞的遷移，且聯(lián)合加藥組阻斷更明顯。這表明，CKI能像G-CSF一樣明顯抑制HL-60細胞的遷移能力，并且兩者具有協(xié)同作用。

表2 各組對HL-60細胞遷移指數(shù)的影響（

表2 各組對HL-60細胞遷移指數(shù)的影響（

注：與空白對照組比較，*P＜0.01；與 SDF-1α 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與 SDF-1α+CKI聯(lián)合 CKI組比較，▲▲P＜0.01；CKI：復(fù)方苦參注射液；G-CSF：粒細胞集落刺激因子；SDF-1α：基質(zhì)細胞衍生因子-1α

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2.2 各組對CXCR4、miR-146a基因表達影響 CKI組、G-CSF組能明顯降低HL-60細胞CXCR4 mRNA表達，聯(lián)合加藥組降低更明顯；CKI組、G-CSF組可以顯著上調(diào)miR-146a mRNA表達（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組對CXCR4 mRNA、miR-146a表達影響

表3 各組對CXCR4 mRNA、miR-146a表達影響

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 G-CSF 聯(lián)合 CKI組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；CKI：復(fù)方苦參注射液；G-CSF：粒細胞集落刺激因子；CXCR4：趨化因子 CXC 受體 4；mRNA：信使 RNA；miR-146a：微小RNA-146a

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2.3 各組CXCR4蛋白表達的影響 CKI組、G-CSF組、CKI聯(lián)合G-CSF組均能夠不同程度抑制CXCR4蛋白表達，尤以聯(lián)合加藥組為甚。見圖1。

圖1 各組對CXCR4蛋白表達的影響

3 討論

1995年日本學(xué)者報道在老年急性髓細胞白血?。ˋML）患者中應(yīng)用預(yù)激方案獲得較高的治療療效、較低的化療相關(guān)心臟毒性和較好的化療耐受性[5]。然而對于CAG方案的具體作用機制目前仍不甚明確，許多研究主要聚焦于以下兩大機制：（1）G-CSF預(yù)激有助于促使處于靜止期（G0期）休眠狀態(tài)的白血病及其前體細胞進入細胞周期，增強阿糖胞苷和阿克拉霉素對它們的細胞毒殺傷作用；（2）通過消弱基質(zhì)細胞對白血病干細胞的保護作用發(fā)揮效應(yīng)[6]?；|(zhì)細胞對白血病的保護作用依賴于骨髓微環(huán)境與白血病細胞之間的直接接觸，而這首先需要白血病細胞遷移、歸巢至骨髓微環(huán)境。在此過程中，表達于白血病細胞表面的CXCR4與基質(zhì)細胞分泌的CXCL12（趨化因子CXC配體12，又稱為基質(zhì)細胞衍生因子-1α，SDF-1α）之間的相互作用占據(jù)著舉足輕重地位[7]。

化療耐藥已成為白血病治療的一大難題，也是目前血液腫瘤研究的前沿?zé)狳c之一。研究表明，骨髓微環(huán)境為白血病細胞提供了“庇護”，使得白血病細胞免于化療藥物誘導(dǎo)的殺傷[6]。據(jù)報道，骨髓微環(huán)境在微觀上可看作無數(shù)特化的微龕（niche），通過與白血病細胞，尤其是白血病干細胞（leukemia stem cells，LSCs）之間的相互作用，促進白血病的發(fā)生、發(fā)展及耐藥[8]。因此，阻斷微環(huán)境與白血病之間的相互作用，增強化療藥物殺傷作用正成為解決化療耐藥的一大方向。在骨髓微環(huán)境-白血病細胞之間的相互作用中，最受人矚目的是CXCR4/CXCL12信號軸[9]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4是介導(dǎo)AML耐藥的關(guān)鍵靶點，CXCR4介導(dǎo)了白血病細胞向骨髓微環(huán)境的遷移、粘附，最終躲避于骨髓微環(huán)境而導(dǎo)致化療耐藥，而利用G-CSF能夠明顯下調(diào)CXCR4蛋白的表達，從而阻斷上述過程。進一步的表觀遺傳學(xué)方面的研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4表達受到miR-146a的調(diào)控，CXCR4可能是miR-146a的靶基因之一，而miR-146a在AML中明顯下調(diào)。同時，G-CSF能夠上調(diào)miR-146a表達。

楊勤等[10]研究發(fā)現(xiàn)，CKI也能夠下調(diào)胃癌細胞的CXCR4蛋白表達而抑制腫瘤細胞的增殖。因此，我們大膽設(shè)想，CKI也能夠作用于miR-146a靶向調(diào)控CXCR4這一靶點，而表現(xiàn)出不俗的增強化療療效、部分逆轉(zhuǎn)耐藥的效果。本研究表明，CKI、G-CSF預(yù)處理HL-60細胞后，其向趨化因子SDF-1α遷移的能力明顯下降，這表明CKI確實能夠影響HL-60細胞的遷移、趨化能力。而進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)CKI能夠明顯上調(diào)miR-146a表達，同時顯著下調(diào)CXCR4 mRNA、CXCR4蛋白的表達，并且與G-CSF具有協(xié)同效應(yīng)。因此，CKI能通過上調(diào)miR-146a表達而下調(diào)CXCR4蛋白表達，從而抑制白血病細胞趨化、遷移能力。目前已經(jīng)知道，白血病細胞趨化、遷移至骨髓微環(huán)境是其受庇護于微環(huán)境并對傳統(tǒng)化療藥物耐藥的先決條件，這說明CKI可能是通過抑制CXCR4表達而抑制白血病細胞的遷移能力，最終打破微環(huán)境—白血病細胞之間的相互作用，而增強化療療效。當(dāng)然，這需要進一步的實驗來證實。

綜上所述，CKI能夠通過上調(diào)miR-146a表達而靶向下調(diào)CXCR4蛋白表達，從而影響HL-60細胞的趨化、遷移能力，并與預(yù)激方案中的重要藥物GCSF具有協(xié)同作用。CKI可能正是通過調(diào)節(jié)miR-146a/CXCR4這一信號途徑打破骨髓微環(huán)境對白血病細胞的保護作用，從而部分逆轉(zhuǎn)耐藥，最終表現(xiàn)為增強CAG等預(yù)激方案的化療療效。