袁雯雯 常化松 玄紅專

（聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，聊城 252059）

蜂膠是西方蜜蜂采集植物樹脂并混入上顎腺、蠟腺等分泌物經(jīng)加工而成的一種膠狀物質(zhì)。蜂膠是一種天然藥物，具備豐富而獨(dú)特的生物活性，如抗細(xì)菌、抗病毒、抗炎癥、抗腫瘤、抗真菌、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)心血管[1-6]等。目前從蜂膠中鑒定出的化學(xué)組分高達(dá)20多類、 600多種，主要有黃酮類、酚酸類、萜烯酸、類固醇類、氨基酸類[7-9]等。中國蜂膠是一種重要的蜂膠類型，主要植物來源為楊屬植物，由于其廣泛的生物學(xué)活性，目前已廣泛應(yīng)用于食品、保健品和藥品等行業(yè)，但其功效成分和作用機(jī)理還未完全闡明。

我們前期通過半制備型高效液相色譜結(jié)合大孔吸附樹脂粗分離的方法，從蜂膠水提物中分離純化出11種化學(xué)成分（咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、短葉松素、咖啡酸芐酯、咖啡酸苯乙酯、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素）[10,11]；此外，通過不同濃度（40%～90%）的甲醇-水洗脫，從蜂膠脂溶性提取物中分離純化出8段物質(zhì)（Ⅰ-Ⅷ）[12]。我們前期實(shí)驗(yàn)表明，蜂膠的抗腫瘤功效成分是黃酮類物質(zhì)及其酯類[11]。蜂膠的抗炎功效成分是否與其抗腫瘤功效成分相同，目前還不清楚。本實(shí)驗(yàn)基于前期分離制備的蜂膠水提物中分離的11種組分和蜂膠乙酸乙酯提取物中分離的8段成分，通過2種不同的炎癥模型，研究了蜂膠抗炎的功效成分，為蜂膠的抗炎活性應(yīng)用提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室保存）。

中國蜂膠產(chǎn)自山東省，膠源植物主要為楊屬植物；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；胰酶、磺酰羅丹明B（SRB）（sigma）；細(xì)胞培養(yǎng)皿、96孔板；Tris（上海生工）；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

HFsafe1200超凈工作臺、MCO-17A CO2培養(yǎng)箱（上海力康科學(xué)儀器有限公司）；TE2000S倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；MK3酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司）；AR2140電子分析天平（美國奧豪斯公司）；優(yōu)普超純水器（成都超純科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蜂膠水溶部位主要組分的分離、純化

蜂膠水溶部位11種組分的分離、純化，具體步驟見[10]，采用大孔吸附樹脂粗分離結(jié)合半制備型高效液相色譜法對蜂膠水溶部位的主要組分進(jìn)行分離、純化，操作步驟如下：（1） 中國蜂膠水提物的制備；（2）醇沉；（3） 大孔吸附樹脂粗分離；（4） 半制備型高效液相色譜分離純化；（5） 純度檢測及結(jié)構(gòu)鑒定。得到11種化合物分別是：咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、短葉松素、咖啡酸芐酯、咖啡酸苯乙酯、芹菜素、松屬素、白楊素、高良姜素。

1.3.2 蜂膠脂溶性部位主要成分的制備、分離、純化、鑒定

蜂膠水提物的殘?jiān)?jīng)乙酸乙酯浸提，然后經(jīng)40%～90%不同濃度的甲醇-水洗脫，得到8段組分（Ⅰ-Ⅷ），具體步驟見[12]。其中，分離到的8段組分，通過HPLC-DAD/Q-TOF-MS分析檢測，主要成分如下表1。

1.3.3 細(xì)胞的培養(yǎng)

HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)在添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。孵育條件為：5% CO2、37℃、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.4 細(xì)胞存活率的測定

表1 蜂膠乙酸乙酯提取物中分離到8段組分的主要化學(xué)成分

將處于對數(shù)生長期的HUVEC按2000個(gè)/孔種植到96孔板，37℃，5% CO2孵育，待細(xì)胞長到60%以上，經(jīng) 100ng/ml LPS 和 40μg/ml ox-LDL 誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，分別經(jīng)不同濃度的咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸（5，10，20μM）、短葉松素、白楊素、松屬素、高良姜素、芹菜素、咖啡酸芐酯、CAPE（0.2，1和 5μM）處理 HUVEC 6，12和 24h，分別經(jīng)不同濃度（1.25，2.5μg/ml）的Ⅰ-Ⅷ 8段提取物處理HUVEC細(xì)胞12h，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用10%三氯乙酸4℃固定1h，然后用SRB染色10min，晾干，100 mM Tris堿溶解，在492nm處測吸光值。

圖1 4種酚酸對LPS誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞存活率的影響

圖2 5種黃酮類化合物對LPS誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞存活率的影響

圖3 2種酯類對LPS誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞存活率的影響

細(xì)胞存活率（%）=（處理組OD值/對照組OD值）×100%

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS v11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 中國蜂膠水提物中11種化學(xué)成分對LPS誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞存活率的影響

2.1.1 4種酚酸對LPS誘導(dǎo)的HUVECs損傷的作用

我們首先檢測了4種酚酸（5，10，20μM）在0.5%血清條件下經(jīng)LPS（100ng/ml）刺激后對HUVECs細(xì)胞存活率的影響。如圖1所示，HUVECs在0.5%血清條件下經(jīng)LPS（100ng/ml）刺激后存活率顯著下降，經(jīng)不同濃度的咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸（5，10，20μM）處理12和24h后對細(xì)胞存活率有一定的促進(jìn)作用?？Х人岷桶⑽核彷^異阿魏酸和3,4-二甲氧基肉桂酸效果更顯著（*P＜0.05，**P＜0.01）。

2.1.2 5種黃酮類化合物對LPS誘導(dǎo)的HUVECs損傷的作用

我們接著檢測了5種黃酮類化合物即短葉松素、松屬素、白楊素、芹菜素、高良姜素（0.2，1和5μM）對LPS刺激的HUVECs細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如圖2所示，短葉松素、松屬素、白楊素在0.2μM時(shí)促進(jìn)細(xì)胞的存活。芹菜素、高良姜素對LPS處理的HUVEC的存活率的影響不明顯（*P＜0.05，**P＜0.01）。

2.1.3 2種酯類化合物對LPS誘導(dǎo)的HUVECs損傷的作用

最后我們檢測了2種酯類即咖啡酸芐酯、CAPE（0.2，1和5μM）對LPS刺激的HUVECs細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如圖3所示，在6h時(shí)，咖啡酸芐酯在5μM的濃度下對LPS處理的HUVECs存活率有促進(jìn)作用，CAPE在12h時(shí)顯著促進(jìn)HUVECs存活率（*P＜0.05，**P＜0.01）。

圖4 11種組分對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞存活率的影響

圖5 不同濃度的8段組分對LPS誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞存活率的影響

2.2 蜂膠水提物中11種組分對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷的作用

此外，我們利用ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，檢測了11種化合物對內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響。由圖4可以看出，11種組分對ox-LDL刺激的HUVECs細(xì)胞存活率的影響不同，其中阿魏酸、異阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、短葉松素、咖啡酸芐酯、松屬素和高良姜素在一定濃度范圍內(nèi)可以促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞增殖（*P＜0.05，**P＜0.01）。

2.3 乙酸乙酯提取物中8段組分對LPS誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞存活率的影響

我們從乙酸乙酯浸提物中通過不同濃度的甲醇-水洗脫得到了8段組分，并通過LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞檢測了8段組分對內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，1.25μg/ml和2.5μg/ml的8段組分能夠保護(hù)LPS造成的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，提高內(nèi)皮細(xì)胞的存活率（*P＜0.05，**P＜0.01）。

3 討論

蜂膠的化學(xué)成分十分復(fù)雜，目前蜂膠應(yīng)用中最大的難題就是藥效不穩(wěn)定，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，本實(shí)驗(yàn)通過2種不同的炎癥細(xì)胞模型對蜂膠水提物中11種組分以及乙酸乙酯提取物中的8段組分對炎癥細(xì)胞的功效分別進(jìn)行了檢測。研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠水提物中11種組分及乙酸乙酯提取物的8段不同組分對2種不同的炎癥細(xì)胞均有不同程度的促進(jìn)細(xì)胞存活率的功效。由此可見蜂膠發(fā)揮抗炎功效的成分比較復(fù)雜，很可能是多種成分的協(xié)同功效，而且酚酸類物質(zhì)在蜂膠抗炎功效中也發(fā)揮了重要作用。在蜂膠抗腫瘤功效成分研究中，發(fā)現(xiàn)蜂膠抗腫瘤的功效成分主要是黃酮類化合物及其酯類物質(zhì)，酚酸類物質(zhì)抗腫瘤功效很弱。由此我們可以推斷出，蜂膠在發(fā)揮不同生物學(xué)功效時(shí)其功效成分并不完全相同。我們需要對蜂膠發(fā)揮不同生物學(xué)活性的功效成分進(jìn)行深入研究，以期為蜂膠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為人類更好的利用蜂膠提供理論依據(jù)。