蒙軍平，張涵，趙潔，孫脊峰

隨著人口老齡化以及人們生活飲食習(xí)慣的改變，糖尿病(diabetes mellitus，DM)的發(fā)病率逐漸升高，DM是由于機體不同發(fā)病機制以及復(fù)合病因所引起胰島素相對或者絕對不足，從而造成患者葡萄糖、脂肪以及蛋白質(zhì)發(fā)生代謝異常[1]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，急性DM相關(guān)并發(fā)癥已得到一定程度的控制，患者生活質(zhì)量得到提高，而以糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)為代表的慢性代謝性疾病的臨床診治效果較差[2]。DN是目前臨床上最為常見的DM并發(fā)癥之一，占30%～35%，以漸進性以及慢性損傷為主要特征[3]。早期一般無典型的相關(guān)癥狀出現(xiàn)，可出現(xiàn)高血壓或者血壓無明顯變化，早期DM患者會出現(xiàn)腎體積增大，漸漸出現(xiàn)高濾過現(xiàn)象，進而導(dǎo)致微量蛋白尿以及間歇性蛋白尿的出現(xiàn)，另外持續(xù)性的高血壓、水腫以及蛋白尿會隨著患者病程的延長逐漸出現(xiàn)，從而造成腎功能不全[4]。由于DN早期無特異性癥狀，容易疏忽漏診，病情逐漸發(fā)展，危及患者生命健康，如能在其早期及時確診，并給予針對性的治療，可及時控制病情[5]。目前臨床上的DN診斷指標大都采用尿白蛋白排泄率，但由于其在糖尿病腎病早期無明顯異常表現(xiàn)，診斷敏感度和特異度較低，故尋找相對可靠的DN診斷指標顯得尤為重要。白蛋白(ALB)是腎小球微血管病變較為敏感的指標，可有效反映蛋白質(zhì)在腎臟中的異常排泄；視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)是反映患者腎小管損傷的敏感性指標，對早期DN的診斷具有一定臨床意義。又由于DN的發(fā)病與單核細胞超化蛋白(MCP-1)等細胞炎性因子有著密切關(guān)系，故筆者分析尿液RBP、ALB在早期糖尿病腎病中的診斷價值及與外周血MCP-1表達關(guān)系，為其臨床診斷提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年9月—2017年12月空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院腎臟內(nèi)科收治的2型糖尿病患者86例作為研究對象，按照患者24 h 尿蛋白排泄率(urinary albumin excretion，UAER)進行分組，UAER﹤30 mg/24 h為單純DM組(46例)，30～300 mg/24 h為早期DN組(40例，其中Ⅰ期12例，Ⅱ期15例，Ⅲ期13例)。單純DM組：男25例，女21例，年齡35～70(46.3±4.6)歲；平均病程(3.2±0.7)年；合并有高血壓22例，蛋白尿15例，腓腸肌痙攣10例。早期DN組：男22例，女18例，年齡36～70(45.8±5.1)歲；平均病程(3.4±0.9)年；合并有高血壓19例，蛋白尿13例，腓腸肌痙攣8例。并取同期來醫(yī)院體檢的42例健康人(口服葡萄糖耐量試驗結(jié)果正常者)作為健康對照組，其中男22例，女20例，年齡35～68(46.1±4.8)歲。3組受試者的性別、年齡等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，患者及家屬同意并積極配合本研究并簽署知情協(xié)議書。

1.2 選擇標準 診斷標準：(1)2型糖尿病診斷標準[6]：符合美國糖尿病協(xié)會(ADA)于2010年制定的標準，患者空腹血糖(8 h內(nèi)無熱量攝入)≥7.0 mmol/L；伴有典型的高血糖以及高血糖危象癥狀者，隨機測定血糖≥11 mmol/L；2 h耐糖試驗顯示，血糖≥11 mmol/L；糖化血紅蛋白≥6.5%者；(2)早期糖尿病腎病分期標準[5]：Ⅰ期主要以患者腎體積以及腎小球的濾過率增加為主要特征，可經(jīng)過治療逐漸恢復(fù)，無相關(guān)組織病理學(xué)損傷；Ⅱ期為患者腎小球出現(xiàn)病理性病變，系膜區(qū)基質(zhì)增多，GBM增厚，但尿白蛋白排除率正常；Ⅲ期即為早期糖尿病腎病。納入標準：(1)年齡在35～70歲，符合上述診斷標準者；(2)近期無嚴重感染者；(3)無其他相關(guān)原因造成的腎臟等相關(guān)泌尿系統(tǒng)疾病者；(4)無相關(guān)家族遺傳史。排除標準：(1)合并有免疫系統(tǒng)疾病者；(2)近期有腎毒性相關(guān)性藥物服用史者；(3)合并有心肝腎等嚴重疾病者；(4)依從性差，中途退出者。

1.3 觀測指標與方法 (1)尿液RBP、ALB測定[7]：取受試者晨尿10 ml，采用醫(yī)用離心機(河北鑫樂科技有限公司)以3 000 r/min速度離心10 min，取其上清液，采用免疫透射比濁法測定，試劑盒均購于上海北加生化試劑有限公司，操作方法嚴格按照說明書進行。陽性率判定： ALB陽性>30 mg/L，RBP陽性>50 mg/L。(2)MCP-1表達[8]：抽取受試者空腹肘靜脈血5ml置于抗凝管備用，1.25 μl被PE標記為鼠抗人MCP-1單抗(上海廣銳生物科技有限公司)和2.5 μl被PE-Cy5標記的鼠抗人CDl4單抗(上海信裕生物科技有限公司)分別加入到檢測管中，MCP-1單抗相應(yīng)的鼠抗人IgG單克隆抗體(上?？泼羯锟萍加邢薰?和2.5 μl的PE-Cy5標記的鼠抗人CDl4單抗加入到對照管中，然后分別向其中加入肝素(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn))100 μl進行抗凝處理。上述樣品避光放置20 min，之后分別向其中加入溶血劑2 ml，在室溫下放置10 min，采用醫(yī)用離心機 1 500 r/min離心5 min，舍棄離心管中的上清液，向其中加入磷酸鹽緩沖液(PBS)2 ml進行重懸處理，再次重復(fù)上述離心處理，之后采用上述PBS緩沖液沖洗3遍，舍棄離心管中的上清液，選用生理鹽水500 μl進行混勻，采用流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)進行MCP-1表達的測定。

2 結(jié) 果

2.1 3組尿液RBP、ALB水平以及外周血MCP-1變化比較 患者尿液RBP、ALB水平以及外周血MCP-1水平早期DN組>單純DM組>健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 3組受試者尿液RBP、ALB水平以及外周血MCP-1變化比較

2.2 不同DN分期患者尿液RBP、ALB水平以及外周血MCP-1變化比較 患者尿液RBP、ALB及外周血MCP-1水平比較，Ⅲ期>Ⅱ期>Ⅰ期，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

2.3 尿液RBP、ALB及RBP+ ALB聯(lián)合診斷早期DN的ROC分析 尿RBP、ALB及RBP+ ALB聯(lián)合診斷早期DN的曲線下面積分別為0.720、0.743、0.982，同時RBP+ ALB聯(lián)合診斷、敏感度以及特異度明顯較高。見圖1、表3。

2.4 RBP、ALB以及RBP+ ALB聯(lián)合診斷的陽性率比較 RBP和ALB單獨診斷早期DN的陽性率均為67.44%(58/86)，而RBP+ALB聯(lián)合診斷的陽性率為88.37%(76/86)，三者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.944，P=0.001)。

2.5 相關(guān)性分析 糖尿病腎病患者的尿液RBP和ALB與外周血MCP-1表達均呈正相關(guān)(r=0.457、0.483，P=0.000、0.032)。

表2 不同DN分期尿液RBP、ALB水平以及外周血MCP-1變化比較

圖1 尿RBP、ALB及聯(lián)合診斷早期DN的ROC曲線下面積

表3 尿RBP、ALB及RBP+ ALB聯(lián)合診斷的Cut-off值、敏感度以及特異度

3 討 論

糖尿病腎病具有典型的病理性變化，表現(xiàn)為腎小球固有細胞及細胞外基質(zhì)增殖，進而形成K-W結(jié)節(jié)、腎小球硬化，腎小管不同程度損傷及間質(zhì)出現(xiàn)不同程度的纖維化，另外在其腎小球的基底膜也會發(fā)生增厚現(xiàn)象[9]。由于早期的糖尿病腎病患者進行尿常規(guī)檢驗時，一般出現(xiàn)蛋白陰性，同時又沒有典型的臨床特征，容易出現(xiàn)誤診漏診現(xiàn)象，而一旦尿常規(guī)檢驗出現(xiàn)蛋白陽性，表明此時患者的腎臟已經(jīng)受到了不可逆的損傷，常規(guī)血糖控制治療難以控制病情的進一步惡化[10]。所以DN的早期發(fā)現(xiàn)，并給予針對性的治療措施，可以及時控制病情，提高患者生存率，改善預(yù)后[11-13]。

ALB是由機體肝臟合成的一種帶有負電荷的微量蛋白，相對分子質(zhì)量不小于6 900，正常情況下，由于電荷屏障分子篩的屏障作用，ALB基本上難以通過腎臟的濾過進入尿液，所以生理條件下尿液中的ALB含量很低[14]。當DM患者長期受外界各種因素的影響，造成腎臟發(fā)生一定程度的損害，腎小球濾膜的電荷屏障以及機械屏障受損，此時會有部分ALB進入腎小球的濾液中，當腎臟受損到一定程度時，腎小球濾液中的ALB含量超過其閾值時，會使患者尿液中的ALB含量增加。診斷陽性率、靈敏度較高。另外，當腎小管出現(xiàn)功能損傷時，即使腎小球功能正常，腎臟的重吸收功能發(fā)生障礙，也會造成尿液中ALB含量升高。再者由于DN患者一般都是長期處于低水平胰島素以及高血糖的內(nèi)環(huán)境下，可以顯著降低腎臟中的硫酸肝素糖蛋白的含量，其主要存在于腎小球基底膜內(nèi)外的疏松層中，從而減少負電荷含量，進而提高尿中ALB的含量[15-16]。健康人尿中ALB的含量一般不超過20 mg/L，含量20～200 mg/L即稱為ALB尿，研究顯示其可以作為早期DN的診斷指標。

本結(jié)果顯示，早期DN患者的尿ALB含量最高。RBP是由患者肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的一種親脂性蛋白質(zhì)，主要分布在尿液、腦脊液以及血清中，在血液中起到一定程度的維生素轉(zhuǎn)運作用，相對分子質(zhì)量在21 000左右[17]。血液中以游離狀態(tài)存在的RBP可以被機體的腎小球濾出，并很快在腎臟的近曲小管部位分解[18]。當患者腎臟的濾過功能受損，超過閾值后，尿液中RBP含量升高，可以相對靈敏地反映患者近曲小管的早期損傷[19-21]。 本結(jié)果顯示，2種指標單獨診斷DN時，其診斷準確率無明顯差異，而2種指標聯(lián)合診斷時，可以一定程度避免其他因素引起的單一ALB或者RBP水平升高所引起的漏診，可以全面的反映患者腎臟腎小管、腎小球以及近曲小管的早期損傷，診斷陽性率、靈敏度均較高。另外ROC曲線下面積越大診斷早期DN價值越大，RBP+ALB聯(lián)合診斷的敏感度以及特異度均明顯較高，故RBP+ ALB具有更好的臨床診斷價值。結(jié)果顯示，DN的發(fā)病與炎性細胞在腎組織的浸潤關(guān)系密切，而MCP-1是由成纖維細胞、單個核細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞以及腎小管上皮細胞分泌產(chǎn)生并在腎臟積聚活化，對DN的發(fā)生以及發(fā)展具有顯著的介導(dǎo)作用，可以一定程度反映患者腎臟的早期損傷[22]。故其表達與尿液RBP、ALB水平呈現(xiàn)正相關(guān)。

綜上所述，尿液RBP+ALB聯(lián)合診斷早期糖尿病腎病的ROC曲線下面積較大，臨床診斷價值較高，并與外周血MCP-1表達呈現(xiàn)正相關(guān)，可以較為靈敏地反映患者的腎功能損傷，有效地避免或者延緩糖尿病腎病的發(fā)生，提高患者的生活質(zhì)量。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

蒙軍平：執(zhí)筆，整理資料，分析資料；張涵：收集整理資料，分析數(shù)據(jù)，圖表設(shè)計；趙潔：收集整理資料，參考書籍查找；孫脊峰：修改總指導(dǎo)