曹舸，余惠，范景秀，康慧，張爾永

急性心肌梗死是以冠狀動脈斑塊破裂、血小板活化、血栓形成為基本特點的心血管疾病，能夠造成冠狀動脈急性閉塞、心肌缺血損傷。在臨床實踐中，尋找能夠早期反映心肌損傷的標(biāo)志物有助于盡早識別心肌梗死，進而及時進行救治、改善預(yù)后[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的進化上高度保守的小分子RNA，分子量21～25 bp且不具備編碼蛋白質(zhì)的功能，主要的生物學(xué)功能是結(jié)合mRNA的3'-非編碼區(qū)來調(diào)節(jié)基因表達并發(fā)揮多種生物學(xué)作用[2-3]。MiR-208是一族在心肌中高表達的miRNA，包括miR-208a、miR-208b 2種成員，參與心臟發(fā)育、心肌功能調(diào)控等過程；當(dāng)心肌細胞發(fā)生破壞時，細胞內(nèi)的miR-208會釋放進入細胞外并成為能反映心肌損害程度的特異性指標(biāo)[4]?，F(xiàn)分析了急性心肌梗死患者體內(nèi)miR-208表達變化與心肌損傷、血小板活化的相關(guān)性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年6月—2017年12月四川大學(xué)華西醫(yī)院心臟大血管外科確診為AMI的患者64例作為AMI組，均符合AMI的診斷標(biāo)準且入院時發(fā)病時間<3 h，排除合并惡性腫瘤、現(xiàn)癥感染、肝腎功能不全的患者以及既往有心肌梗死、腦梗死病史的患者。64例中男38例，女26例，年齡39～63(56.51±7.62)歲；發(fā)病至入院時間(2.25±0.35)h；合并癥：高血壓29例，糖尿病24例，高脂血癥37例。隨機選擇同期進行健康體檢的志愿者52例作為對照組，男29例，女23例，年齡37～60(57.12±7.24)歲，既往均無心臟疾病且體檢心電圖正常。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者及家屬同意并簽署知情同意書，具有可比性。

1.2 觀察指標(biāo)及方法

1.2.1 miR-208表達： 采用康為世紀公司的血液RNA提取試劑盒(CW0538S)提取外周靜脈血中的RNA，而后采用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(SW2142S)將RNA反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA；取cDNA樣本并按照miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒配置反應(yīng)體系，進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系見表1。miR-208b的上游引物序列為5’-AAUGCUAGCUAGCUAGCUA-3’，下游引物序列為5’-CUAGUCAUGCAUGCGUAGCA-3’。根據(jù)反應(yīng)后計算機軟件中生成的曲線讀取Ct值，根據(jù)公式2-△△Ct計算miR-208a、miR-208b的表達量。

表1 PCR反應(yīng)體系及步驟

1.2.2 心肌損傷指標(biāo)： 采集外周靜脈血后分離血清，應(yīng)用南京建成公司的相應(yīng)分子試劑盒進行操作，測定肌鈣蛋白I(cTnI)、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)、內(nèi)皮素-1(ET-1)的含量，測定方法為放射免疫沉淀法。

1.2.3 血小板活化指標(biāo)： 采集外周靜脈血后分離血漿，應(yīng)用Santa Cruz公司生產(chǎn)的PAC-1、P-selectin的熒光抗體進行標(biāo)記，在流式細胞儀上測定PAC-1、P-selectin的含量，以陽性標(biāo)記的血小板百分率表示；采用上海西唐公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒測定血小板活化因子(PAF)和脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)、血栓素B2(TXB2)的含量，測定方法為酶聯(lián)免疫吸附法。

2 結(jié) 果

2.1 miR-208表達比較 與對照組比較，AMI組患者外周血中miR-208a表達升高(P<0.01)，miR-208b無顯著變化(P>0.05)，見表2。

表2 2組血漿中miR-208a、miR-208b表達比較

2.2 心肌損傷指標(biāo)比較 與對照組比較，AMI組患者血清cTnI、CK-MB、MDA、ET-1水平顯著升高(P<0.01)，見表3。

表3 2組血清心肌損傷指標(biāo)比較

2.3 血小板活化指標(biāo)比較 與對照組比較，AMI組患者血清P-selectin、PAC-1、TXB2、PAF、Lp-PLA2含量升高(P<0.01)，見表4。

2.4 相關(guān)性分析 AMI組患者血漿中miR-208a的表達量與cTnI、CK-MB、MDA、ET-1、P-selectin、PAC-1、TXB2、PAF、Lp-PLA2的含量呈正相關(guān)(r=0.683、0.626、0.596、0.653、0.585、0.703、0.495、0.531、0.628，P=0.004、0.007、0.016、0.005、0.018、0.002、0.022、0.019、0.009)。

表4 2組血清血小板活化指標(biāo)的比較

3 討 論

急性心肌梗死治療的關(guān)鍵是早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療。肌鈣蛋白及心肌酶譜等臨床上用于診斷心肌梗死的輔助檢查指標(biāo)具有較強的特異性，但在發(fā)病早期的靈敏度不佳，心肌梗死發(fā)生后較長時間才釋放進入血液循環(huán)，當(dāng)相應(yīng)指標(biāo)發(fā)生明顯升高時多已出現(xiàn)了不可逆的心肌損害，進而延誤了最佳的治療時機。miR-208是近年來發(fā)現(xiàn)的具有心肌細胞特異性的一族miRNA，包括miR-208a和miR-208b 2種成員[5]。本研究通過分析發(fā)病3 h以內(nèi)的AMI患者外周血miR-208表達量的變化可知：AMI組外周血中miR-208a的表達量較對照組升高，miR-208b的表達量與對照組比較無變化。結(jié)合2種miR-208的功能進行分析，miR-208b主要表達于胎兒的心肌組織，參與心臟發(fā)育過程并且表達量在成年后逐步減少；miR-208a主要表達于成人的心肌組織，參與心肌細胞內(nèi)肌球蛋白重鏈及輕鏈結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)，對維持心肌細胞的正常舒縮功能具有重要意義[6]。本研究結(jié)果提示miR-208a在急性心肌梗死發(fā)生后的早期已經(jīng)出現(xiàn)了高表達，通過測定外周血中miR-208a的表達量能夠為AMI的早期識別提供依據(jù)。

心肌細胞在缺血缺氧的作用下發(fā)生損傷和破裂后，除了miR-208a的大量釋放外，細胞內(nèi)多種結(jié)構(gòu)分子和功能分子也會大量釋放。臨床實驗室對心肌損傷標(biāo)志物的測定是直接檢測蛋白含量，但蛋白成分復(fù)雜且存在相似的位點，實驗室檢測存在一定誤差，盡管能夠反映心肌損傷的程度、卻無法在早期靈敏地識別疾病[7-8]。cTnI和CK-MB分別是心肌細胞內(nèi)高度特異性的結(jié)構(gòu)分子和功能分子，前者參與肌鈣蛋白的組成、后者參與能量代謝的調(diào)控[9-10]；MDA和ET-1是心肌損害過程中繼發(fā)性發(fā)生改變的分子，前者是缺氧后氧自由基大量生成并修飾脂質(zhì)后形成的產(chǎn)物，后者是心肌梗死過程中內(nèi)皮細胞破壞后的產(chǎn)物[11-13]。本研究對AMI患者外周血中以上心肌損傷標(biāo)志物的分析發(fā)現(xiàn)：AMI組患者外周血中cTnI、CK-MB、MDA、ET-1的含量較對照組升高。結(jié)果提示AMI患者體內(nèi)心肌的缺血缺氧損害會造成細胞內(nèi)的多種分子釋放增多；AMI組患者外周血中miR-208a的表達量與cTnI、CK-MB、MDA、ET-1含量呈正相關(guān)。由此說明miR-208a的高表達不僅能夠為AMI的早期識別提供依據(jù)，還能準確反映和評估心肌缺血損害的程度。

AMI病程中血小板活化和聚集是重要的病理生理特征，冠狀動脈內(nèi)斑塊破裂后血栓的形成依賴于血小板的活化和聚集[14-15]，miR-208a在心肌組織中不僅參與心肌細胞功能的調(diào)節(jié)，同時也被證實與血小板的功能有關(guān)。李恩等[16]研究報道，急性冠狀動脈綜合征患者體內(nèi)miR-208a與血小板分布寬度及平均血小板體積有關(guān)，但AMI病程中miR-208a對血小板活化的影響仍有待進一步闡明。P-selectin、PAC-1、TXB2、PAF、Lp-PLA2是反映血小板活化的指標(biāo)，本研究的分析發(fā)現(xiàn)：AMI組患者外周血中P-selectin、PAC-1、TXB2、PAF、Lp-PLA2的含量較對照組升高。進一步分析miR-208a高表達與血小板活化指標(biāo)的關(guān)系可知：AMI組患者外周血中miR-208a的表達量與P-selectin、PAC-1、TXB2、PAF、Lp-PLA2的含量呈正相關(guān)。結(jié)合血小板活化指標(biāo)進行分析，P-selectin、PAC-1是血小板表面與血小板活化直接相關(guān)的分子，前者在血小板活化后大量表達于血小板表面并且能夠促進血小板在斑塊破裂部位大量黏附，后者是活化的血小板表面高表達的受體、能夠促進纖維蛋白原的結(jié)合及血栓的形成[17]。TXA2是花生四烯酸代謝過程中生成的具有促凝活性的產(chǎn)物，能夠促進血小板發(fā)生聚集，TXB2是其代謝后生成的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的產(chǎn)物，能夠反映TXA2的生成量[18]；PAF、Lp-PLA2是血小板聚集的誘導(dǎo)劑，兩者間能夠相互作用并共同促進血小板在斑塊破損處發(fā)生聚集[19]。本研究的結(jié)果提示miR-208a的高表達與AMI患者體內(nèi)血小板的過度活化有關(guān)，通過miR-208a表達量的測定能夠評估血小板的活化程度。

綜上所述，AMI患者外周血中miR-208a表達增多且與心肌損傷、血小板活化程度相關(guān)，可為疾病的早期識別以及心肌損傷、血小板活化程度的評估提供依據(jù)。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

曹舸、張爾永：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；余惠：實施研究過程，資料搜集整理，進行統(tǒng)計學(xué)分析；范景秀、康慧：分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核