孫芳立，蘇忠亮，郭慶增

(1.青島科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與安全工程學(xué)院，山東 青島 266042；2.青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266042)

隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展、公眾環(huán)保意識的增強，糧食安全越來越受到人們的重視.其中，重金屬對糧食作物的危害是糧食安全亟待解決的問題之一.據(jù)不完全統(tǒng)計，在20世紀(jì)90年代，我國遭受Cd污染的農(nóng)田面積超過了1.3×104hm2，近些年Cd的污染狀況還有進一步增強的趨勢[1].Cd一旦對土壤造成污染，不僅對植物有嚴(yán)重的毒害作用，而且會進一步通過食物鏈最終危害人體健康[2].小麥?zhǔn)俏覈匾募Z食作物，在世界上也是主要的糧食作物之一.目前有關(guān)Cd對水稻污染的報道很多[3-5]，但是Cd對小麥的污染機制研究相對較少.不同的重金屬在不同的植物細胞內(nèi)，其富集和分布是存在差異的，即使是同種重金屬，在不同植物組織細胞的亞細胞結(jié)構(gòu)中，其富集也存在很大差異.植物吸收重金屬后，會對重金屬在組織水平和亞細胞水平進行選擇性分配.這種分配與植物的重金屬防御機制密切相關(guān)[6-7].Cd是耕地土壤中受到廣泛關(guān)注的重金屬污染物之一，因此研究Cd在小麥亞細胞中的富集規(guī)律對于研究植物的重金屬防御機制和食品安全具有重要的意義.

重金屬在小麥不同器官中的富集規(guī)律是不同的[8-9]，主要的富集器官是根.Cd在小麥的不同生育期，其富集規(guī)律也有很大的差異[10].在小麥的幼苗期，Cd在小麥根與莖葉中的富集濃度隨著處理濃度的增加而增加[11]，但是在其他的生育期重金屬吸收Cd還需要能量的主動運輸，因此Cd的富集濃度不再與處理濃度呈正相關(guān)[12].Cd在小麥的器官中富集后，會進一步毒害小麥的組織細胞，進而影響小麥的正常生長發(fā)育.植物為抵御重金屬的毒害，自身具有一套抵御裝置.例如，細胞壁會與Cd結(jié)合，限制Cd進一步進入細胞[13]；雖然Cd在根細胞中的富集濃度增加，但是在莖葉中的富集濃度不一定會隨之增加[14].

目前關(guān)于Cd在小麥不同器官中的富集規(guī)律已經(jīng)有了一些報道[10，15-16]，但是在亞細胞水平上關(guān)于Cd在小麥全生育期的研究卻鮮有報道.小麥在世界上也是十分重要的糧食作物，但是目前研究重金屬對植物的毒害實驗，大都是采用培養(yǎng)液培養(yǎng)試驗或者是盆栽試驗[17]，這種培養(yǎng)方法與小麥在田間的實際生長存在很大的差異.

小麥?zhǔn)嵌拘詫嶒灣Ｓ玫臉?biāo)準(zhǔn)物種之一，筆者采用田間小區(qū)試驗，保證水肥、培養(yǎng)等條件與田間小麥一致，研究Cd在小麥全生育期中亞細胞中的富集規(guī)律，以便進一步探討小麥對Cd的解毒機制.

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

該研究在青島市城陽京口村進行，以Cd為研究對象，參照土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB15618-1995)，重金屬Cd設(shè)置5個梯度：對照(CK)、低劑量(L1)、中劑量(L2)、高劑量(L3)以及超高劑量(L4)，其濃度梯度分別為0，1，3，5，8 mg·kg-1.Cd以一層過篩土一層CdSO4溶液形式噴灑于每個小區(qū)，并翻土混勻加入土壤中.小區(qū)土壤本底相關(guān)理化性質(zhì)見表1.試驗田共設(shè)置45相同的個小區(qū)，每個小區(qū)面積為6 m2，通過在小區(qū)之間增設(shè)PVC隔板或田埂進行隔離.小麥在2014年10月8日播種，每小區(qū)播種量110 g.分別在分蘗期、拔節(jié)-孕穗期、抽穗-揚花期、灌漿期對小麥進行采樣并測定其不同亞細胞中Cd的含量，每個樣品重復(fù)測試2次，最終結(jié)果取2次測量值的平均.

表1 田間小區(qū)土壤本底理化性質(zhì)

1.2 材 料

實驗供試材料為濟麥22.實驗用水均為去離子水，實驗所涉及的一些常規(guī)化學(xué)試劑主要是：硝酸、高氯酸、鹽酸、蔗糖、三異丙基乙磺酰、鹽酸、二硫赤鮮糖醇，試劑規(guī)格為分析純，均購自中國天津市巴斯夫化工有限公司.

主要儀器與設(shè)備：Hitachi超速冷凍離心機CR21GIII,日本日立公司;AA600型石墨爐原子吸收儀,美國PE公司;AA400型火焰原子吸收儀,美國PE公司;玻璃研缽、電加熱板、通風(fēng)櫥.

1.3 方 法

植物樣品前期處理[18]：每個試驗田隨機選擇5個點進行樣品采集，用自來水沖洗掉附著在小麥鮮樣表面的浮土，再擦干水.然后分別剪下根和莖葉，剪碎后稱量.

4 ℃冰浴研磨：剪碎后的小麥莖葉、根的鮮樣各稱取1.000 0 g，放入洗凈、烘干后的玻璃研缽中，分次加入5mL預(yù)冷的提取液研磨成勻漿(提取液組成為：250 mmol·L-1蔗糖，50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.5)和1.0 mmol·L-1的二硫赤蘚糖醇)，然后將勻漿轉(zhuǎn)移到50 mL的離心管中，再用15 mL同樣的提取液多次洗滌研缽中的殘留物，一并轉(zhuǎn)移到離心管中.

4 ℃冷凍離心：參照文獻[18-19]的方法將研磨成勻漿的小麥鮮樣在4 ℃的條件下冰浴離心. 首先將勻漿在3 000 r·min-1下離心15 min，沉淀為含有細胞壁的殘渣部分.再將上清液在15 000 r·min-1的條件下二次離心30 min，二次離心的上清液為細胞質(zhì)溶液，二次離心殘渣為小麥細胞器組分[19].

消化：參照文獻[18-19]的方法向離心后的一次離心上清液、二次離心上清液和二次離心的殘渣分別加入10 mL體積比為1∶9的HNO3-HClO4溶液，酸化反應(yīng)一段時間后，將其轉(zhuǎn)移到250 mL的錐形瓶中. 用5 mL體積比為1∶9的HNO3-HClO4溶液洗滌盛放二次離心殘渣的離心管，而盛放兩次離心上清液的離心管用去離子水洗滌，并將洗滌液一并轉(zhuǎn)移到錐形瓶中. 在錐形瓶上放入漏斗進行冷卻水回流，然后將錐形瓶放到電加熱板開始加熱. 加熱采取逐步升溫的方法，先將溫度調(diào)到120 ℃加熱30 min，隨后升溫到180 ℃加熱30 min，然后再升溫至220 ℃進行消化. 1 h后取下漏斗，加熱到近干，再加入2 mL體積比為1∶3的H3PO4溶液，并用10～20 mL去離子水沖洗錐形瓶壁，將錐形瓶放到電加熱板上加熱10 min，取下，冷卻至室溫[19].

測定：根據(jù)文獻[18]的方法將消化好的溶液轉(zhuǎn)移，定容，用石墨爐原子吸收儀測定Cd含量.

在小麥的成熟期以及灌漿期，由于小麥葉片以及麥穗開始干枯發(fā)黃，難以研磨進行亞細胞分離，因此只測得地上部分干樣數(shù)據(jù)進行總質(zhì)量分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd在小麥不同生育期各亞細胞中的分布

在不同的生育期，Cd的富集規(guī)律也是不同的.除了拔節(jié)-孕穗期Cd的主要富集器官是葉之外，Cd在小麥不同時期的主要富集器官是根.在亞細胞水平，Cd的富集位點以富集量大小依次是細胞質(zhì)溶液>細胞壁>細胞器，具體結(jié)果如圖1所示.

圖1 小麥不同生育期不同器官中Cd的濃度分布

如圖1所示，Cd在分蘗期、拔節(jié)-孕穗期、抽穗-揚花期小麥的根、莖葉細胞的各個亞細胞結(jié)構(gòu)中的富集濃度是隨著處理水平的增加而增加.總體來看，Cd是主要富集在細胞質(zhì)溶液中，其次是細胞壁，而在細胞器中的富集濃度最少.這與楊衛(wèi)東、宋曉慧等[20-21]的研究結(jié)果一致，也進一步詮釋和體現(xiàn)了小麥對重金屬Cd的防御機制.土壤中的重金屬在進入細胞時首先與植物細胞細胞壁上的非原生質(zhì)體結(jié)合.這是由于原生質(zhì)體含有的大量的多糖分子或蛋白質(zhì)分子具有大量活性基團(如:羧基、羥基、氨基).這些活性基團通過配位作用將Cd固定在細胞壁表面，阻止Cd進入細胞，達到減少重金屬跨膜運輸?shù)哪康膹亩档椭亟饘賹毎亩竞ψ饔肹15，22-23].但是當(dāng)土壤中的重金屬含量過多，細胞壁不足以固定這些重金屬時，重金屬就會進入細胞，此時細胞的第二種防御機制就開始發(fā)揮作用.植物為降低重金屬的危害，高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器即會分泌細胞膜類似物將進入細胞的重金屬進行包裹固定，這一防御機制叫作區(qū)隔化作用[13].重金屬的區(qū)隔化極大地阻止了重金屬進入細胞器，防止重金屬進一步危害維持細胞正常生理功能的細胞器的功能和結(jié)構(gòu).Cd在進入細胞之后，除了會進行區(qū)隔化，還會與細胞中的植物絡(luò)合素以及金屬硫蛋白中的巰基官能團結(jié)合，降低Cd的毒性[24].

如圖1(a)所示，Cd在灌漿期主要的富集器官是根，在葉中的富集濃度相對較低.這是由于根是直接與土壤中重金屬接觸的器官，Cd首先在根部富集之后，經(jīng)過根的截留作用，才會向地上部分轉(zhuǎn)移.這也是植物對重金屬的一種解毒機制的體現(xiàn)，將重金屬固定在根部，防止其向地上部分轉(zhuǎn)移，危害植物的其他重要器官[11].Cd在小麥根細胞的各個亞細胞結(jié)構(gòu)中的富集濃度隨著處理水平的增加呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢.Cd在根細胞各亞細胞中的富集濃度高低為：細胞質(zhì)溶液>細胞壁>細胞器.Cd在葉細胞中的富集濃度隨著處理水平的增加一直呈現(xiàn)出增加的趨勢，其在葉細胞中富集濃度依次為：細胞壁≈細胞質(zhì)溶液>細胞器.Cd在根與莖葉這兩種細胞器中不同的重金屬分布也進一步證實了，在低濃度Cd脅迫下，細胞器的固定是細胞主要的解毒機制，隨著Cd的濃度增加，細胞質(zhì)溶液的區(qū)隔化作用更加顯示出優(yōu)勢.

如圖1(b)所示，Cd在拔節(jié)-孕穗期主要的富集器官是葉，在根中的富集濃度相對較低.這是由于在小麥的根細胞中Cd的富集濃度相對于分蘗期較低，而在葉細胞中的富集濃度比較高，這是由于在這一時期，重金屬Cd更多地向地上部分進行了轉(zhuǎn)移.分析其原因，可能是由于在拔節(jié)-孕穗期，小麥的地上部分進入迅速增長的階段，物質(zhì)的轉(zhuǎn)運速率高于積累速率，Cd會隨著其他物質(zhì)一起向地上部分轉(zhuǎn)移，所以Cd的富集部位也開始從地下部分轉(zhuǎn)移到地上部分，主要的富集器官是葉.Cd在根細胞各亞細胞中的富集濃度依次為：細胞質(zhì)溶液>細胞壁>細胞器.Cd在葉細胞中的富集濃度隨著處理水平的增加一直呈現(xiàn)增加的趨勢，其在葉細胞中富集濃度依次為：細胞壁≈細胞質(zhì)溶液>細胞器.這一點與分蘗期小麥亞細胞對Cd的富集規(guī)律一致.

如圖1(c)所示，Cd在抽穗-揚花期主要的富集器官是根.Cd在小麥根、葉細胞的細胞壁上的富集濃度是隨著處理水平的增加而增加，在葉細胞質(zhì)溶液中的富集濃度是持續(xù)增加，而在根、葉的其他亞細胞結(jié)構(gòu)中則是先增加然后達到平衡.Cd在根、葉器官的各亞細胞中的富集規(guī)律呈現(xiàn)為:細胞質(zhì)溶液>細胞壁>細胞器.

如圖1(d)所示，Cd在灌漿期主要的富集器官是根.Cd在小麥根細胞的各個亞細胞結(jié)構(gòu)中的富集濃度也是隨著處理水平的增加呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，在處理水平為L3時富集濃度達到最大，說明在小麥灌漿期，L3處理水平是小麥所能承受的臨界濃度.當(dāng)處理濃度大于此濃度時，可能會對細胞造成不可逆的損傷，使小麥細胞對Cd的富集濃度反而下降；也可能會使細胞的吸收營養(yǎng)物質(zhì)的機制受損，導(dǎo)致小麥根部吸收物質(zhì)的濃度降低，從而Cd的富集濃度也隨之降低.在根細胞各亞細胞中的富集特征是:細胞質(zhì)溶液>細胞壁>細胞器.Cd在葉細胞中的富集濃度隨著處理水平的增加而增加，其在葉細胞中的富集特征是細胞壁≈細胞質(zhì)溶液>細胞器.

如圖1(e)所示，Cd在成熟期的主要富集器官是根，且Cd在根以及葉中的富集規(guī)律均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢.Cd的富集濃度在處理水平為L2時達到最大，說明在成熟期，處理水平L2為小麥對Cd的承受臨界濃度.

2.2 Cd在小麥全生育期根、葉細胞中的分布規(guī)律

在根細胞中，Cd在小麥中的富集濃度隨著生長時間的延長呈現(xiàn)出先降低后增加的趨勢，分蘗期和灌漿期的富集濃度要高于拔節(jié)-孕穗期和抽穗-揚花期；在葉細胞中，Cd在小麥亞細胞中的富集濃度呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，分蘗期和灌漿期的富集濃度則低于拔節(jié)-孕穗期和抽穗-揚花期.即使是在相同的濃度下，不同的生育期，Cd在根細胞以及葉細胞中的分布都是不同的.

圖2為Cd在小麥全生育期根細胞和葉細胞中的分布規(guī)律.

圖2 不同生育期中Cd在小麥器官中的分布

如圖2所示，隨著小麥的生長發(fā)育，在每一處理水平下Cd在根細胞中的富集濃度出現(xiàn)先降低后增加的現(xiàn)象，而在葉細胞中的富集濃度則出現(xiàn)先增加后降低的現(xiàn)象.分析其原因，可能是在小麥的分蘗期，小麥生長發(fā)育還沒有成熟，機體對重金屬的防御機制還不完善.所以Cd在根細胞中的富集濃度要高于其他的生育期[10].小麥在拔節(jié)-孕穗期發(fā)育迅速，其生長速率要高于積累速率，所以Cd的總富集濃度出現(xiàn)下降趨勢.另外，這一時期是小麥迅速長高的階段，重金屬離子會隨著其他營養(yǎng)物質(zhì)向地上部分轉(zhuǎn)移，所以Cd在葉中的富集濃度要高于根，并且也高于其他幾個時期[10].在抽穗-揚花期，小麥的生長速率要大于重金屬的吸收速率，所以重金屬在小麥根、葉中的富集濃度下降.在灌漿期，小麥開始趨于成熟，根開始出現(xiàn)老化現(xiàn)象，所以在這個時期小麥在根中的富集濃度開始上升[24].

3 結(jié)束語

除拔節(jié)-孕穗期，Cd在小麥中的主要富集器官是葉外，其他生長時期，Cd在小麥中的主要富集器官都是根.這是植物對重金屬的一種解毒機制的體現(xiàn)，將重金屬固定在根部，防止其向地上部分轉(zhuǎn)移危害植物的其他重要器官.小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物，根阻止Cd向地上部分的轉(zhuǎn)移，保證了主要的食用部分籽粒中的富集濃度較低，對于食品安全是有利的.

在亞細胞水平，無論是哪個生育期，Cd在小麥中的主要富集部位是細胞質(zhì)溶液，其次是細胞壁，而在細胞器中的富集濃度非常低.這說明細胞壁對重金屬的絡(luò)合以及細胞質(zhì)溶液對Cd的區(qū)隔化可能是小麥解毒的主要機制.但是，要闡明重金屬對小麥的毒害機制還需要進一步研究小麥超微結(jié)構(gòu)以及相關(guān)酶系的變化.

在同一種處理水平下，不同的生育期，Cd在小麥中的富集規(guī)律是不同的，因此可以為進一步建立一種新的重金屬監(jiān)測機制提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ).