尹利端，王桐，宋文山，劉楚怡，3，*，仲米存，杜芬，李八方，3

（1.煙臺(tái)新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)有限公司，山東煙臺(tái)264006；2.青島海洋生物醫(yī)藥研究院，山東青島266001；3.中國海洋大學(xué)，山東青島266073）

松花粉是指經(jīng)人工采集得到的干燥松樹花粉，作為生命的遺傳物質(zhì)，含有豐富的蛋白質(zhì)、微量元素、黃酮及必需脂肪酸等營養(yǎng)成分[1]及生物活性物質(zhì)[2]，具有抗衰老、抗氧化、抗疲勞、促進(jìn)生長發(fā)育、調(diào)整機(jī)體代謝等多種功效[3]。目前松花粉水提物的制備技術(shù)已相對成熟，并形成了國珍松花粉等一系列在售產(chǎn)品。但在松花粉水提物的制備過程中，卻產(chǎn)生了大量的松花粉粕殘?jiān)@些殘?jiān)羞€存在著大量優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源尚未得到充分利用。一般認(rèn)為松花粉中蛋白質(zhì)勝于酪蛋白，且質(zhì)量高于牛肉、雞蛋蛋白[4]。簡單的丟棄松花粉粕不僅會(huì)帶來環(huán)境的壓力，也造成了大量營養(yǎng)物質(zhì)的浪費(fèi)。因此，安全高效的從松花粉粕中制備具有生物活性的松花肽，成了亟待解決的問題。目前國內(nèi)關(guān)于從松花粉粕中制備活性松花肽的研究未見報(bào)道，利用松花粉粕開發(fā)具有生物活性的松花肽，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

生物活性肽就是指一類相對分子質(zhì)量小于6 kDa，介于氨基酸與蛋白質(zhì)之間的分子聚合物[5]，具有增強(qiáng)機(jī)體防御功能、調(diào)節(jié)生命節(jié)律、預(yù)防疾病和促進(jìn)康復(fù)等多種生物學(xué)功能的多肽[6]。具有增強(qiáng)免疫功能的活性肽稱作免疫活性肽[7]。近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些天然免疫活性膚如胸腺膚等，可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分化、增殖與成熟，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力[8]，提高機(jī)體對外界病原物質(zhì)的抵抗能力，提高免疫低下小鼠的免疫活性[9]。部分免疫活性肽已經(jīng)作為一種免疫因子應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床抗感染、免疫缺乏癥的治療上，并且起到了良好的治療效果[10]。

本研究從松花粉粕中制備1 kDa～3 kDa和小于1 kDa兩種分子量的松花肽，并按照《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）[11]要求，對兩種平均分子量松花肽的增強(qiáng)免疫力功能進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

松花粉粕：山東煙臺(tái)新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)有限公司；胰蛋白酶（10 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；無水乙醇（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、三氯乙酸（分析純）、三氟乙酸（分析純）、硫化鈉（分析純）、乙腈（色譜純）：北京化學(xué)試劑公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 [3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]、牛血清蛋白、維生素B12、谷胱甘肽及膠原蛋白：Sigma公司；Giemsa液：索萊寶公司。

Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 1100型氨基酸自動(dòng)分析儀：美國安捷倫公司；MSM2013實(shí)驗(yàn)室用膜分離設(shè)備：上海摩速科學(xué)器材有限公司；UV-2010PC紫外可見分光光度計(jì)：尤尼克（上海）儀器有限公司；Versamax Tunable Microplate Reade光柵式恒溫酶標(biāo)儀：Versamax Tunable公司；BX43熒光顯微鏡：Olympus公司。

SPF級昆明小鼠：山東朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

1.2 不同分子量松花肽的制備

將松花粉粕粉碎后配成溶液，調(diào)節(jié)pH值到12，在水浴中攪拌提取1 h后，4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，收集上清，調(diào)節(jié)pH值至4.5，離心，收集沉淀，加水復(fù)溶為2.5%的松花蛋白溶液，加入4 000 U/g胰蛋白酶，在pH8.5，50℃的條件下分別酶解60 min和240 min后，進(jìn)一步將制備得到的各酶解產(chǎn)物分別利用實(shí)驗(yàn)室用膜分離設(shè)備通過管式超濾膜1 kDa～3 kDa和小于1 kDa兩個(gè)分子量段超濾，進(jìn)行樣品的分離制備，并通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）驗(yàn)證其平均分子量，得到1 kDa～3 kDa和＜1 kDa的2組松花肽。

1.3 分子量分布的測定

使用TSK GEL G2000SWXL色譜柱，通過高效液相色譜測定2種松花肽的分子量分布。檢測條件為：以體積比1∶1的乙腈與0.2%三氟乙酸混合溶液為流動(dòng)相，按0.5 mL/min的流速過柱，紫外檢測波長為225 nm。取牛血清蛋白、維生素B12、谷胱甘肽及膠原蛋白樣品各1 mg，分別溶于1 mL的純水中，用0.45 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。結(jié)果通過GPC軟件進(jìn)行分析。

1.4 氨基酸組成的分析

松花肽的氨基酸組成通過氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測。總氨基酸的組成分析：采用OPA柱前衍生反相高效液相色譜法測定。將松花肽置于水解管中，加入6 mol/L的HCl溶液，真空封口，在110℃下水解24 h，OPA柱前衍生（脯氨酸、羥脯氨酸是與氯甲基芴甲酯反應(yīng)）后注入Agilent 1100型氨基酸自動(dòng)分析儀測定氨基酸組成。游離氨基酸的組成分析：樣品用等體積三氯乙酸沉淀，經(jīng)過濾、離心后，取上清液注入Agilent 1100型氨基酸自動(dòng)分析儀測定氨基酸組成。

1.5 動(dòng)物分組與計(jì)量選擇

選用6～8周齡，體重18g～22g的SPF級昆明種雌性小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)中兩組松花肽各設(shè)3個(gè)劑量組，試驗(yàn)樣品的推薦用量為每人每日6.0g，按60kg體重計(jì)，相當(dāng)于0.1g/（d·kg·BW），按人體推薦量的5、10、20倍確定小鼠的低、中、高劑量，即各組小鼠每日劑量分別為0.5、1.0、2.0g/（kg·BW）。以人體推薦量的10倍為中劑量組，另設(shè)兩個(gè)劑量組，分別為人體推薦劑量的5倍和20倍，另有一個(gè)空白對照組，以大豆肽為陽性對照組。即將試驗(yàn)動(dòng)物分成8組，每組30只，分別為：陽性對照，1kDa松花肽低劑量，1 kDa松花肽中劑量，1 kDa松花肽高劑量，1 kDa～3kDa松花肽低劑量，1kDa～3kDa松花肽中劑量，1 kDa～3kDa松花肽高劑量和陰性對照。

1.6 刀豆蛋白A（concanavalin，ConA）誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

按照《保健食品評價(jià)與檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)范》中的試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，各劑量組動(dòng)物每組10只，連續(xù)灌胃一個(gè)月后頸椎脫臼法處死動(dòng)物，無菌取脾，置于盛有適量無菌Hanks液的小平皿中，研磨脾臟，制成當(dāng)個(gè)細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hanks液洗2次，每次1 000 r/min離心10 min后懸浮細(xì)胞于RPMI1640完全培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液分兩孔，每孔1mL，加入24孔培養(yǎng)板中，再加75 μL ConA 液（100 μg/mL），另一孔作為對照，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔輕輕吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入 50 μLMTT（5 mg/mL），持續(xù)培養(yǎng) 4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。將溶解液移入96孔培養(yǎng)皿中，每孔做3個(gè)平行孔，用酶標(biāo)儀在570 nm測定吸光值。

淋巴細(xì)胞增殖能力=加Con A的光密度值-不加Con A的光密度值

1.7 血清溶血素的測定

按照《保健食品評價(jià)與檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)范》中的試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，各劑量組動(dòng)物每組10只，連續(xù)灌胃一個(gè)月后，每鼠腹腔注射20%壓積綿羊紅細(xì)胞（sheep red blood cells，SRBC）生理鹽水細(xì)胞混懸液 0.2 mL，連續(xù)給藥5 d，于最后一次給藥后1 h，從小鼠眼眶靜脈叢取血，離心分離血清，取血清用生理鹽水稀釋500倍，取稀釋血清1 mL置試管中，加10%SRBC混懸液0.5 mL，置于冰浴中，再加入以生理鹽水1∶10稀釋的豚鼠血清1 mL混合，另設(shè)不加血清的空白對照。移置37℃恒溫水浴保溫10 min后，冰浴中終止反應(yīng)。用2 000 r/min離心10 min后取上清1 mL，加入都氏試劑3 mL，混勻放置10min，取上清液于540 nm測吸光度值。另取10%SRBC混懸液0.25 mL與3.75 mL都氏試劑混合，540 nm測定OD值，作半數(shù)溶血值。

血清溶血素含量以半數(shù)溶血值（HC50）表示。按下式計(jì)算：

1.8 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

八組試驗(yàn)動(dòng)物分別連續(xù)灌胃一個(gè)月后，每只鼠腹腔注射20%雞紅細(xì)胞懸液1 mL，間隔30 min，頸椎脫臼處死動(dòng)物，將其仰位固定于鼠板上，正中剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2 mL，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1 min，然后吸出腹腔洗液1 mL，平均分滴于2片載玻上，放入墊有濕沙布的搪瓷盒內(nèi)，移置37℃孵育30 min后，除去未貼片細(xì)胞，晾干，以1∶1（體積比）丙酮甲醇溶液固定，4%（體積分?jǐn)?shù)）Giemsa液染色3 min，再用蒸餾水漂洗晾干，油鏡下計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞，按下式計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)：

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種松花肽分子量的驗(yàn)證

HPLC及GPC軟件分析得到松花肽的平均分子量及分子量分布按照試驗(yàn)條件酶解60 min時(shí)，得到的松花肽平均分子量為1 673 Da，能夠較好的滿足1 kDa～3 kDa松花肽的要求，通過超濾得到1 kDa～3 kDa松花肽；當(dāng)酶解4 h時(shí)，平均分子量為784 Da，能夠滿足小于1 kDa松花肽的要求，通過超濾得到小于1 kDa松花肽。松花肽的分子量分布見表1。

表1 松花肽的分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of pine pollen peptides

2.2 松花肽的氨基酸組成分析

對兩種松花肽的氨基酸組成進(jìn)行分析，各氨基酸具體組成含量如表2所示。

表2 松花肽的氨基酸組成表Table 2 Amino acid composition of pine pollen peptides

兩種松花肽必需氨基酸含量分別為55.2%和57.0%。兩種松花肽的必需氨基酸含量均高于聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）推薦值。并且與FAO/WHO提出的食物中推薦氨基酸需求相比，所有必需氨基酸的含量均高于FAO/WHO要求，可見其能夠成為人類優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源。

2.3 ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

通過ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)探討兩種分子量的松花肽對細(xì)胞免疫功能的影響。細(xì)胞免疫功能中兩個(gè)劑量組的結(jié)果為陽性，即可判定細(xì)胞免疫功能結(jié)果陽性。結(jié)果如圖1所示。

圖1 兩種松花肽對小鼠細(xì)胞免疫活性的影響Fig.1 Effect of two kinds of pine pollen peptides on the cellular immune activity in mice

通過小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)探討其對細(xì)胞免疫功能的影響發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，陽性對照組、1 kDa低劑量組、1 kDa中劑量組、1 kDa～3 kDa中劑量組和1 kDa～3 kDa高劑量組都存在極顯著差異（P＜0.05）。說明在以上4個(gè)不同分子量和劑量組的松花肽樣品具有極顯著的增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖能力。按照小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)要求，說明兩種松花肽均具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫的活性。

2.4 松花肽對小鼠血清溶血素含量影響

松花肽對小鼠血清溶血素的影響反應(yīng)了松花肽對小鼠體液免疫功能的影響。體液免疫功能中兩個(gè)劑量組結(jié)果陽性，可判定體液免疫功能結(jié)果陽性，結(jié)果見圖2。

圖2顯示，與陰性對照相比，除＜1 kDa松花肽高劑量組差異不顯著外，其他試驗(yàn)組以及陽性對照的半數(shù)溶血值均極顯著增加，說明兩個(gè)分子量松花肽均具有增強(qiáng)體液免疫力活性。

2.5 松花肽對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響

圖2 松花肽對小鼠血清溶血素含量的影響Fig.2 Effect of pine pollen peptides on blood-serum erythrocytolysin in mice

松花肽對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力體現(xiàn)了松花肽對小鼠的單核-巨噬細(xì)胞免疫功能的影響。若其中兩個(gè)劑量組結(jié)果陽性，可判定單核-巨噬細(xì)胞免疫功能結(jié)果陽性。對染色的涂片通過顯微鏡逐一計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞以及吞噬雞紅細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 松花肽對小鼠單核-巨噬細(xì)胞免疫功能的影響Fig.3 Effect of pine pollen peptide on mononuclear-macrophage immune function

與陰性對照組相比，陽性對照組、1 kDa松花肽的3個(gè)劑量組和1 kDa～3 kDa 3個(gè)劑量組都存在極顯著差異（P＜0.05）。按照巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)要求，說明兩個(gè)不同分子量和劑量組的松花肽樣品具有極顯著的增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力，即兩種松花肽均具有增強(qiáng)單核-巨噬細(xì)胞免疫活性的功能。

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，兩種分子量的松花肽均具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能和單核-巨噬細(xì)胞功能的作用。按照《保健食品評價(jià)與檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)范》要求，對增強(qiáng)免疫力的功能判定要求為，在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性4個(gè)方面任兩個(gè)方面結(jié)果陽性，可判定該受試樣品具有增強(qiáng)免疫力功能。因此，1kDa松花肽和1kDa～3 kDa松花肽均具有增強(qiáng)免疫力功能。

3 結(jié)論

平均分子量在1 kDa～3 kDa和小于1 kDa的兩種分子量的松花肽均具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能和單核-巨噬細(xì)胞功能的作用，因此，1 kDa松花肽和1 kDa～3 kDa松花肽均具有增強(qiáng)免疫力功能。