賀興波， 鄭弘毅， 楊建芬， 劉 瑤△， 任精華

(1贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院， 2贛南醫(yī)學(xué)院， 江西 贛州 341000； 3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心， 湖北 武漢 430022)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種高度惡性的腫瘤，其典型特點(diǎn)是增殖速度快、侵襲性強(qiáng)，腫瘤血供往往不能滿足生長(zhǎng)所需, 由此使得肝癌細(xì)胞處于低氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的應(yīng)激微環(huán)境中[1]。充足的能量供應(yīng)是肝癌細(xì)胞在此應(yīng)激環(huán)境中無(wú)限增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的前提和必要條件[2]。線粒體是細(xì)胞的能量工廠，在線粒體自噬、分裂/融合和線粒體生物合成的協(xié)同作用下，限制和延緩功能受損線粒體的積累，可達(dá)到對(duì)線粒體的質(zhì)量控制(mitochondrial quality control)[3]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)是一種非組蛋白DNA結(jié)合蛋白，除了通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤新生血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移參與肝癌發(fā)病外，還可誘導(dǎo)線粒體自噬[4]，調(diào)節(jié)腫瘤能量代謝，參與肝癌發(fā)病。我們采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)肝癌細(xì)胞HMGB1的表達(dá)，觀察缺氧環(huán)境下細(xì)胞線粒體功能的變化并從線粒體生物合成角度探討其可能的機(jī)制，為闡明HMGB1如何調(diào)控肝癌生長(zhǎng)提供一個(gè)新視點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株

人肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自ATCC，傳代并液氮保存于贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心。

2 主要試劑和儀器

RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清(Gibco)；Lipofectamine?2000(Invitrogen)；HMGB1小干擾RNA(HMGB1 small interfering RNA,HMGB1-siRNA)及陰性對(duì)照siRNA(negative control siRNA, siRNA-NC; Cat#stQ0002758-1)(銳博生物科技有限公司)；MitoSOXTMRed Mitochondrial Superoxide Indicator(Thermo Fisher Scientific)；增強(qiáng)型ATP檢測(cè)試劑盒(Cat#S0027)、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1; Cat# C2006)和基因組DNA小量抽提試劑盒(Cat#D0063)(碧云天生物技術(shù)研究所)；抗過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)輔助激活因子1α(PPARγ coactivator-1α，PGC-1α)抗體(Cat#ab54481)和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)抗體(Cat#ab131607)(Abcam)；抗核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1，NRF1)(Cat#46743)抗體(Cell Signaling Technology)；抗β-actin抗體(Cat#5441)(Sigma)；DNA凝膠回收試劑盒(Cat#AP-GX-50)(AXYGEN)；ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Cat#Q311-02/03)(諾唯贊生物科技有限公司)；BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒(Cat#BCA-02)(鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)。CO2-N2-O2三氣培養(yǎng)箱(Eppendorf); NanoDrop微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)。

3 主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)中培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)于6 cm細(xì)胞皿(每皿8×105個(gè)細(xì)胞)，每3 d傳代1次。細(xì)胞隨機(jī)分為HMGB1-siRNA1/2/3干擾組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，待細(xì)胞融合度為30%～50%時(shí)，按Lipofectamine? 2000說(shuō)明書(shū)操作轉(zhuǎn)染50 nmol/L HMGB1-siRNA和siRNA-NC，4 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24～72 h，采用RT-qPCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，篩選具有最佳沉默效果的干擾組用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為缺氧(hypoxia)組：細(xì)胞在缺氧條件(1% O2+5% CO2+94% N2)下培養(yǎng)；Hypoxia+HMGB1-siRNA組：常氧培養(yǎng)條件下，待細(xì)胞融合度為30%～50%時(shí)，轉(zhuǎn)染50 nmol/L HMGB1-siRNA，4 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)入缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；Hypoxia+siRNA-NC組：常氧培養(yǎng)條件下，待細(xì)胞融合度為30%～50%時(shí)，轉(zhuǎn)染50 nmol/L negative control siRNA，4 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)入缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞線粒體活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平 用13 μL 的DMSO溶解MitoSOX red，制成5 mmol/L儲(chǔ)存液于-20 ℃避光保存，染色時(shí)用PBS將儲(chǔ)存液稀釋成5 μmol/L的工作液。各組細(xì)胞加入1 mL MitoSOX red工作液，37 ℃避光孵育10 min后，PBS洗滌細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位(Ψm)水平 PBS洗滌各組細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，重懸于0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入0.5 mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻，37 ℃孵育20 min。孵育期間配制JC-1染色緩沖液，冰浴備用。孵育結(jié)束后，4 ℃、600×g離心4 min，棄上清。用JC-1染色緩沖液重懸、洗滌細(xì)胞，4 ℃ 600×g離心4 min，棄上清，用500 μL PBS重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3.5RT-qPCR檢測(cè)線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷貝數(shù) 選擇mtDNA特異性的編碼基因COXI作為檢測(cè)基因，以該基因與核基因18sRNA內(nèi)參照的相對(duì)表達(dá)量作為線粒體基因拷貝數(shù)的衡量指標(biāo)。提取細(xì)胞全基因組DNA，NanoDrop分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度,-20 ℃保存?zhèn)溆?。SYBR Green法分別擴(kuò)增COXI和18sRNA，COXI的上游引物序列為5’-ACTAACAGACCGCAACCTCAAC-3’，下游引物序列為5’-TCCGAAGCCTGGTAGGATAAG-3’；18sRNA的上游引物序列為5’-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3’，下游引物序列為5’-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3’。擴(kuò)增產(chǎn)物行經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收，NanoDrop測(cè)定DNA濃度, 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)=6.02×1014×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/L)/(DNA片段長(zhǎng)度×660)。以無(wú)菌去離子水2倍倍比梯度稀釋18sRNA和COXI標(biāo)準(zhǔn)品，ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行不同梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品COXI和18sRNA的擴(kuò)增, 以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)CT值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將每個(gè)樣本COXI基因所得CT均值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線算出拷貝數(shù)MX，將18sRNA內(nèi)參照所得CT均值經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算得出拷貝數(shù)MP，最終算得該樣本的mtDNA相對(duì)拷貝數(shù)變化為n=MX/MP。

3.6ATP檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP生成量 各組細(xì)胞加入裂解液于冰上裂解，4 ℃、12 000×g離心5 min，取10 μL上清測(cè)蛋白濃度并將各樣品濃度調(diào)至均一，剩余上清冰浴備用。黑色96孔板內(nèi)每孔加入100 μL ATP檢測(cè)工作液，室溫放置3～5 min，再加入50 μL待測(cè)樣品(每組設(shè)3組平行孔)。按試劑盒要求配制ATP標(biāo)準(zhǔn)品，使用Thermo Scientific Varioskan LUX多功能微孔板讀數(shù)儀選擇Luminometer模塊檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算ATP生成量。

3.7Western blot法檢測(cè)細(xì)胞線粒體生物合成相關(guān)蛋白表達(dá)的變化 按試劑盒要求提取各組細(xì)胞總蛋白并定量。取40 μg總蛋白變性5 min，進(jìn)行SDS-PAGE，按照Marker切去需要的凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5% BSA室溫封閉1 h，加入特異性 I 抗(濃度均為1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜；室溫TBST漂洗4次，每次15 min；加入II抗(1∶10 000)，37 ℃孵育1 h，室溫漂洗4次,每次15 min。反應(yīng)信號(hào)經(jīng)化學(xué)熒光底物發(fā)光，X線膠片曝光。使用ImageJ軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析, 測(cè)定目的條帶和內(nèi)參照β-actin的灰度值，結(jié)果以樣本灰度值/內(nèi)參照灰度值表示。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均由3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得出，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，當(dāng)方差分析結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，再采用SNK-q法行多重比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HMGB1-siRNA對(duì)HMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)的影響

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,干擾組HMGB1的mRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組均有不同程度的下降，以HMGB1-siRNA3組下降最為明顯(P<0.05)，兩對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖1A。Western blot結(jié)果顯示,干擾組的HMGB1蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組均有不同程度下降，以HMGB1-siRNA3組的抑制效果最強(qiáng)(P<0.05)，見(jiàn)圖1B。結(jié)果表明HMGB1-siRNA可有效抑制肝癌細(xì)胞HepG2中HMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，同時(shí)選取HMGB1-siRNA3干擾序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 HMGB1對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體活性氧簇水平的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，hypoxia+HMGB1-siRNA組細(xì)胞的MitoSox平均熒光強(qiáng)度明顯高于hypoxia組(P<0.01)和hypoxia+siRNA-NC組(P<0.01),hypoxia組和hypoxia+siRNA-NC組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖2。

3 HMGB1對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，hypoxia+HMGB1-siRNA組的JC-1由紅色向綠色轉(zhuǎn)變明顯增多，即紅/綠熒光的相對(duì)比例下降至3.06±0.27，膜電位明顯低于hypoxia組(15.85±5.44，P<0.01)和hypoxia+siRNA-NC組(15.20±2.17，P<0.05);hypoxia組和hypoxia+siRNA-NC組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖3。

4 HMGB1對(duì)HepG2細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)的影響

Hypoxia+HMGB1-siRNA組細(xì)胞的COXI mRNA表達(dá)水平明顯低于hypoxia組和hypoxia+siRNA-NC組(P<0.05),hypoxia組和hypoxia+siRNA-NC組相比較無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖4。

5 HMGB1對(duì)HepG2細(xì)胞ATP生成量的影響

Hypoxia+HMGB1-siRNA組細(xì)胞的ATP生成量明顯低于hypoxia組(P<0.01)和hypoxia+siRNA-NC組(P<0.01),hypoxia組和hypoxia+siRNA-NC組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖5。

Figure 1.The effect of HMGB1-siRNA transfection on the expression of HMGB1 at mRNA and protein levels in the HepG2 cells. A: the mRNA expression of HMGB1 detected by RT-qPCR; B: the protein expression of HMGB1 detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and siRNA-NC group.

圖1HMGB1-siRNA對(duì)HMGB1mRNA和蛋白表達(dá)的影響

6 HMGB1對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體生物合成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，hypoxia+HMGB1-siRNA組的線粒體生物合成相關(guān)蛋白PGC-1α、NRF1和TFAM的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于hypoxia組(P<0.01)和hypoxia+siRNA-NC組(P<0.05)；hypoxia組和hypoxia+siRNA-NC組相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖6。

討 論

線粒體生物合成是細(xì)胞在發(fā)育、運(yùn)動(dòng)[5]、饑餓、炎癥、缺氧和能量限制等刺激下，新生線粒體形成以維持及恢復(fù)線粒體結(jié)構(gòu)、數(shù)量與功能的一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程[6]，它和線粒體自噬和線粒體分裂/融合共同調(diào)節(jié)，保持細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量、形態(tài)和功能的動(dòng)態(tài)平衡[7-8]。PGC-1α是線粒體生物合成最重要的調(diào)節(jié)因子[9]，PPARs、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)反應(yīng)元件結(jié)合蛋白等可誘導(dǎo)PGC-1α的轉(zhuǎn)錄激活[10]。除此以外，能量感受器AMP活化的蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)介導(dǎo)的磷酸化修飾、乙酰轉(zhuǎn)移酶GCN5介導(dǎo)的乙?；癗AD+依賴的沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)介導(dǎo)的去乙?；揎椧部捎绊慞GC-1α的亞細(xì)胞定位調(diào)控其活性。激活的PGC-1α轉(zhuǎn)位至胞核與NRF1結(jié)合后，轉(zhuǎn)錄激活TFAM的表達(dá)，維持細(xì)胞內(nèi)正常線粒體的數(shù)量并增強(qiáng)線粒體呼吸鏈氧化磷酸化功能，平衡能量供應(yīng)，滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖的代謝需求[11]。

HMGB1是一種高豐度的細(xì)胞核非組蛋白DNA結(jié)合蛋白，其既可在正常生命活動(dòng)中發(fā)揮作用，也在許多病理現(xiàn)象中充當(dāng)重要角色[12]。核內(nèi)的HMGB1參與穩(wěn)定核小體、易化基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)和調(diào)控等多種細(xì)胞生命活動(dòng)；在血供/氧供不足、營(yíng)養(yǎng)缺乏、炎癥和氧化應(yīng)激等刺激因素的作用下，經(jīng)甲基化、乙酰化、磷酸化和ADP核糖基化等蛋白質(zhì)翻譯后修飾的HMGB1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至細(xì)胞漿，激活自噬抑制凋亡；HMGB1還可由受刺激的免疫細(xì)胞主動(dòng)分泌或由損傷、壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放到細(xì)胞外，與其受體——晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)和Toll樣受體2/4(Toll like receptor 2/4，TLR2/4)等結(jié)合從而引發(fā)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控炎癥反應(yīng)、啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答及激活腫瘤細(xì)胞修復(fù)和增殖、分化和再生機(jī)制[13]。

Figure 2.The effect of HMGB1 on mitochondrial superoxide level in HepG2 cells. A: HepG2 cells were divided into 3 groups, and then stained with MitoSox red and analyzed by flow cytometry; B: the quantitative analysis of A. Mean±SD.n=3.*P<0.05vshypoxia group and hypoxia+siRNA-NC group.

圖2HMGB1對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體活性氧簇水平的影響

研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在肝癌的發(fā)病過(guò)程中扮演癌基因的角色[14]，其參與肝癌發(fā)病的可能機(jī)制有：(1)增加細(xì)胞周期蛋白D1和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖[15]；(2)與RAGE結(jié)合導(dǎo)致HCC中新生血管生成[16]；(3)與胞漿內(nèi)的beclin-1結(jié)合，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞保護(hù)性自噬[17]；(4)釋放至胞漿的HMGB1與mtDNA結(jié)合，通過(guò)激活TLR9信號(hào)通路，誘導(dǎo)肝癌生長(zhǎng)[18]；(5)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)的抑制劑:伴有kazal基序富含半胱氨酸的逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)蛋白(reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motif，RECK)和組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子3(tissue inhibitors of metalloproteinase 3，TIMP3)，誘導(dǎo)MMP的表達(dá)從而促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移[19]。

HMGB1能否通過(guò)調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞能量代謝發(fā)揮促癌作用，目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道不多。Tang等[4]的研究指出，核內(nèi)HMGB1是熱休克蛋白β-1(heat shock protein beta-1，HSPB1)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，后者有穩(wěn)定線粒體還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)和提高葡萄糖6磷酸脫氫酶的作用，15、86位絲氨酸磷酸化的HSPB1還能調(diào)控細(xì)胞微絲骨架的聚合和重構(gòu)。無(wú)論缺失HMGB1還是HSPB1，都將導(dǎo)致細(xì)胞微絲骨架發(fā)生異常，影響線粒體自噬關(guān)鍵分子Parkin的線粒體轉(zhuǎn)位和線粒體外膜電壓依賴陰離子通道1(voltage-dependent anion-selective channel protein 1，VDAC1)的泛素化，最終抑制胞內(nèi)線粒體自噬體的組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞表現(xiàn)為線粒體片段化，有氧呼吸和ATP產(chǎn)生減少，腫瘤增殖受限。

鑒于HMGB1可以通過(guò)誘導(dǎo)線粒體自噬，清除功能受損的線粒體，參與腫瘤能量代謝，我們認(rèn)為有必要研究HMGB1能否通過(guò)調(diào)控線粒體的生物合成，使腫瘤細(xì)胞在應(yīng)激環(huán)境刺激下保持線粒體功能的正常行使，產(chǎn)生充足能量供腫瘤快速增殖。本文中我們采用功能缺失策略分析缺氧環(huán)境下HMGB1對(duì)線粒體功能和線粒體生物合成的影響，結(jié)果顯示與hypoxia組和hypoxia+siRNA-NC組相比，缺氧環(huán)境下，當(dāng)HMGB1表達(dá)被抑制后，細(xì)胞線粒體活性氧簇含量明顯升高，線粒體膜電位、mtDNA拷貝數(shù)和ATP產(chǎn)生量明顯下降，且線粒體生物合成相關(guān)蛋白表達(dá)有一定程度下降，該結(jié)果和我們前期體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)靶向干擾HMGB1后，肝癌細(xì)胞在缺氧環(huán)境下增殖速度和克隆形成率明顯降低及PGC-1α的表達(dá)被抑制[11]，以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腹腔注射化學(xué)誘癌劑二乙基亞硝胺后，肝臟組織特異性敲除HMGB1小鼠的肝癌發(fā)生率和腫瘤組織內(nèi)PGC-1α表達(dá)量明顯下降，生存期顯著延長(zhǎng)具有相同的趨勢(shì)[20]。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)缺氧環(huán)境下HMGB1通過(guò)影響線粒體生物合成，誘導(dǎo)新生線粒體形成并維持應(yīng)激環(huán)境下細(xì)胞線粒體的正常功能，但HMGB1是否通過(guò)影響PGC-1α的胞內(nèi)定位及翻譯后修飾發(fā)揮上述作用有待進(jìn)一步研究。

Figure 3.The effect of HMGB1 on mitochondrial membrane potentials in HepG2 cells detected by JC-1 staining. A: HepG2 cells were divided into 3 groups, and then incubated with the JC-1 dye and analyzed by flow cytometry. Representative dot plots: J-aggregated red fluorescence (polarized cells); JC-1 monomer green fluorescence (depolarized cells); B: the quantitative analysis of A. Mean±SD.n=3.*P<0.05vshypoxia group and hypoxia+siRNA-NC group.

圖3JC-1檢測(cè)HMGB1對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響

Figure 4.The effect of HMGB1 on the copy number of mitochondrial DNA in the HepG2 cells detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vshypoxia group and hypoxia+siRNA-NC group.

圖4RT-qPCR檢測(cè)HMGB1對(duì)HepG2細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)的影響

Figure 5.The effect of HMGB1 on intracellular ATP production in the HepG2 cells. The cellular ATP concentration was measured by bioluminescence assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vshypoxia group and hypoxia+siRNA-NC group.

圖5HMGB1對(duì)HepG2細(xì)胞ATP生成量的影響

Figure 6.The effects of HMGB1 on the protein expression of mitochondrial biogenesis associated molecules. Mean±SD.n=3.*P<0.05vshypoxia group and hypoxia+siRNA-NC group.

圖6Westernblot檢測(cè)HMGB1對(duì)線粒體生物合成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響