陳興無(wú)， 邢 敏， 秦立龍， 孫珍貴， 臧蕾蕾， 王寒黎

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 安徽 蕪湖 241001)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的重要特征在于進(jìn)行性氣道炎癥導(dǎo)致氣流受限和肺功能持續(xù)減退,其臨床過(guò)程中的關(guān)鍵事件是COPD急性加重(acute exacerbation of COPD，AECOPD)，后者更進(jìn)一步加速肺功能下降、損害健康狀況并增加死亡風(fēng)險(xiǎn)，多由感染尤其是細(xì)菌感染觸發(fā)。巨噬細(xì)胞的重要功能之一是吞噬病原體，研究證明COPD患者氣道巨噬細(xì)胞吞噬能力減弱是細(xì)菌長(zhǎng)期定植和AECOPD次數(shù)增多的核心[1]。巨噬細(xì)胞作用發(fā)揮與其表型密切相關(guān)，已確定2種類型巨噬細(xì)胞：干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導(dǎo)的促炎或經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(M1巨噬細(xì)胞),白細(xì)胞介素4(interleukin-4，IL-4)和IL-13誘導(dǎo)的抗炎或替代性活化巨噬細(xì)胞(M2巨噬細(xì)胞)。其中M1巨噬細(xì)胞表達(dá)高水平促炎細(xì)胞因子，在宿主防御細(xì)菌和病毒中發(fā)揮核心作用；M2巨噬細(xì)胞有助于炎癥的消退和損傷修復(fù)。因此，這2種表型巨噬細(xì)胞的相對(duì)比例對(duì)COPD疾病發(fā)展具有重要影響。COPD氣道中的復(fù)雜環(huán)境可以改變高度可塑的巨噬細(xì)胞表型。

氣道感染與嚴(yán)重的局部低氧相關(guān)，后者是COPD氣道炎癥微環(huán)境的一種常見(jiàn)現(xiàn)象。COPD患者通氣驅(qū)動(dòng)減弱，氣道阻塞，肺泡壁增厚，肺泡毛細(xì)血管被破壞，從而在肺內(nèi)形成缺氧區(qū)域。此外，急性加重過(guò)程中氣道的感染和炎癥使得氧氣被炎癥細(xì)胞消耗，造成氧濃度低于1%(<8 mmHg)的低氧微環(huán)境。已知腫瘤組織低氧環(huán)境是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAMs)表型轉(zhuǎn)換的最主要原因[2]。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是低氧和炎癥過(guò)程中激活的一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)免疫和炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)發(fā)揮關(guān)鍵作用，影響巨噬細(xì)胞炎性因子基因表達(dá)、表型和功能狀態(tài)。已報(bào)道COPD患者肺組織中支氣管上皮和上皮下纖維化組織HIF-1α表達(dá)上調(diào)或下調(diào)[3]。在部分人群HIF-1α遺傳多態(tài)性與COPD呈正相關(guān)。由于缺氧是COPD氣道微環(huán)境的持續(xù)性特征，探討低氧環(huán)境巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換和吞噬活性的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。

氣道上皮細(xì)胞是氣道和外界環(huán)境接觸的第一道屏障，其通過(guò)調(diào)節(jié)固有免疫在預(yù)防和控制氣道感染發(fā)揮重要作用。正常情況下，上皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞密切聯(lián)系，氣道上皮細(xì)胞-巨噬細(xì)胞通迅紊亂被認(rèn)為是早期炎癥信號(hào)的一個(gè)關(guān)鍵事件[4]。

我們假設(shè)低氧狀態(tài)下氣道上皮細(xì)胞-巨噬細(xì)胞異常的串?dāng)_可能是巨噬細(xì)胞表型和吞噬功能變化的重要誘因。本研究以氯化鈷(cobalt chloride，CoCl2)刺激氣道上皮細(xì)胞模擬低氧環(huán)境，選擇趨化因子配體3(chemokine ligand 3，CCL3)作為M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，CD163、CD206和CCL18作為M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，利用細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，探討氣道上皮細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞表型和吞噬活性的影響及HIF-1α的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cells，HBE cells; 江蘇齊式生物科技有限公司)；人單核細(xì)胞系THP-1(杭州赫貝生物技術(shù)有限公司)。CoCl2、12-肉豆蔻酸13-乙酸佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)和fluorescein isothiocyanate (FITC) isomer I(Sigma)；抗CD68抗體(Santa Cruz)；Alexa Fluor? 488 donkey anti-rabbit IgG(Life)；anti-human CCL3 PE、anti-human CD163 APC、anti-human CD206 APC、mouse IgG1κ isotype control PE、mouse IgG1κ isotype control APC(eBioscience)；mouse anti-human CCL18 PE(BD)；溴化乙啶(ethidium bromide，EB；上海生工生物有限公司)；RNA提取試劑盒(上海捷瑞生物工程公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa)；定量PCR試劑盒SuperReal PreMix Color(北京天根生化科技公司)。Accuri流式細(xì)胞儀(BD)。

2 方法

2.1THP-1細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 THP-1常規(guī)培養(yǎng)于含10%類胎牛血清(similar fetal bovine serum，SFBS)的DMEM培養(yǎng)液，以每孔5.0×105鋪至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入終濃度為100 μg/L的PMA進(jìn)行誘導(dǎo)分化。24 h后，進(jìn)行免疫熒光染色，顯微鏡下觀察誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞。

2.2HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染 HBE細(xì)胞以每孔5.0×105的密度接種培養(yǎng)于不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液(含10% SFBS)的24孔板，70%～80%融合后，換無(wú)血清培養(yǎng)液用于轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分5組：對(duì)照(control)組(不轉(zhuǎn)染)、陰性對(duì)照siRNA(negative control siRNA, NC siRNA)組、HIF-1α-Homo-488 siRNA組、HIF-1α-Homo-1216 siRNA組和HIF-1α-Homo-1553 siRNA組。siRNA均由GenePharma合成，序列見(jiàn)表1。轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)，將5 μL siRNA 和5 μL Lipofectamine 3000分別溶于500 μL不含青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)液中，室溫靜置5 min，混勻，靜置20 min后加入24孔板中。24 h后，利用RT-qPCR評(píng)估沉默效率。沉默效率最高的用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 siRNA序列

2.3HBE細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng) HBE細(xì)胞以5.0×105鋪至24孔Transwell小室上室，培養(yǎng)于含10% SFBS的DMEM。24 h后換無(wú)血清培養(yǎng)基并以CoCl2處理，共分5組：HBE+CoCl2(0 μmol/L)組、HBE+CoCl2(100 μmol/L)組、HBE+CoCl2(200 μmol/L)組、HBE+CoCl2(400 μmol/L)組和HBE+CoCl2(800 μmol/L)組。各組細(xì)胞經(jīng)CoCl2處理24 h，與上述誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)8 h、12 h或24 h，收獲上室HBE細(xì)胞用于隨后的HIF-1α mRNA檢測(cè)，收集下室巨噬細(xì)胞用于流式細(xì)胞術(shù)分析。

在證實(shí)CoCl2(800 μmol/L)和HIF-1α-Homo-488 siRNA實(shí)驗(yàn)效果最佳的基礎(chǔ)上，為探討HIF-1α的作用，將HBE細(xì)胞以每室5.0×105鋪至24孔Transwell小室上室，分3組：HBE+NC siRNA組(NC組)、HBE+HIF-1α-Homo-488 siRNA組(siRNA組)和HBE+HIF-1α-Homo-488 siRNA+CoCl2(800 μmol/L)組(siRNA-800組)。HBE細(xì)胞轉(zhuǎn)染同2.2，CoCl2同時(shí)加入，然后與誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24 h。

2.4乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性的測(cè)定 按LDH測(cè)試試劑盒說(shuō)明書(shū)(博士德)用酶標(biāo)儀(Bio-Rad)測(cè)量490 nm 的吸光度(A)值。測(cè)定重復(fù)3次。

2.5免疫熒光染色 誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞以4%多聚甲醛4 ℃固定15 min，PBS漂洗，0.1% Triton X-100溶液穿透，1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)+0.3 mol/L甘氨酸封閉。滴加CD68抗體200 μL，4 ℃過(guò)夜，室溫30 min，PBS漂洗，滴加Alexa Fluor? 488 donkey anti-rabbit IgG 200 μL，37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗。1% 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)室溫染核，PBS漂洗、甘油封片，熒光顯微鏡下(×200)觀察、拍照。

2.6RNA分離和RT-qPCR 按試劑盒說(shuō)明用RNA快速提取試劑盒提取總RNA，定量并評(píng)估RNA完整性。使用PrimeScriptTMRT試劑盒合成cDNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。定量PCR試劑盒SuperReal PreMix Color進(jìn)行qPCR。β-actin表達(dá)作為內(nèi)參照，數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。Homo-HIF-1α 的正向引物序列為5’-AGGCTACTTGTATCTTCTG-3’，反向引物序列為5’-CGTTGTGAGTGGTATTATTC-3’；內(nèi)參照Homo-ACTB的正向引物序列為5’-TAACGCAACTAAGTCATA-3’，反向引物序列為5’-TGAAGATCAAGATCATTG-3’。

2.7流式細(xì)胞術(shù)分析巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá) 收集共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，加入450 μL的PBS重懸，各取110 μL到4支EP管中，分別加入5 μL 抗CCL3、CD163、CD206和CCL18特異性抗體染色細(xì)胞，避光孵育30 min，同型對(duì)照細(xì)胞用PE或APC標(biāo)記的mouse IgG1κ isotype染色，用于非特異性背景染色。使用BD Accuri C6軟件通過(guò)BD公司的Accuri C6流式細(xì)胞儀分析CCL3、CD163、CD206和CCL18的表達(dá)。

2.8巨噬細(xì)胞吞噬大腸桿菌的檢測(cè) 按方法2.3將巨噬細(xì)胞與不同濃度CoCl2處理的HBE共培養(yǎng)24 h；接種大腸桿菌于2%瓊脂LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃孵育24 h，挑取單個(gè)菌落于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過(guò)夜。離心去上清，加入1.25 mL 1% Triton X-100和5 mL FITC (20 mg/L)，37 ℃避光孵育15 min，離心去上清，PBS重懸。將FITC標(biāo)記大腸桿菌加入共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中(大腸桿菌∶巨噬細(xì)胞=20∶1)，37 ℃慢速搖動(dòng)，每20 min取搖勻液0.5 mL，PBS漂洗，70%乙醇固定10 min，離心后加入1 mL EB(0.5 mg/L)，37 ℃避光孵育15 min，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬大腸桿菌能力。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用方差分析，與對(duì)照組比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

以CD68抗體作為巨噬細(xì)胞標(biāo)志物，經(jīng)100 μg/L PMA誘導(dǎo)24 h后，THP-1巨噬細(xì)胞組CD68免疫熒光染色陽(yáng)性，而陰性對(duì)照組CD68免疫熒光染色陰性，表明THP-1細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The immunofluorescence analysis of CD68 expression in the THP-1 cells (×200). The scale bar=50 μm.

圖1THP-1細(xì)胞CD68免疫熒光分析

2 siRNA對(duì)HBE細(xì)胞HIF-1α表達(dá)的影響

與NC siRNA組相比，HIF-1α-Homo-488 siRNA、HIF-1α-Homo-1216 siRNA和HIF-1α-Homo-1553 siRNA均顯著抑制HIF-1α的mRNA表達(dá)(P<0.05),其中HIF-1α-Homo-488 siRNA抑制效果最明顯，因此選擇HIF-1α-Homo-488 siRNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The relative mRNA expression levels of HIF-1α in the HBE cells transfected with siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC siRNA group.

圖2轉(zhuǎn)染siRNA的HBE細(xì)胞HIF-1αmRNA相對(duì)表達(dá)水平的變化

3 CoCl2對(duì)HBE細(xì)胞LDH釋放和HIF-1α表達(dá)的影響

100～800 μmol/L的CoCl2處理24 h后，HBE細(xì)胞的LDH釋放量分別為0.61±0.05 (100 μmol/L組)、0.64±0.03 (200 μmol/L組)、0.67±0.04 (400 μmol/L組)和0.68±0.04 (800 μmol/L組)，與對(duì)照組(0.61±0.03)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。不同濃度CoCl2處理后，HBE細(xì)胞HIF-1α的mRNA表達(dá)水平均隨CoCl2濃度的增加呈上升趨勢(shì)，800 μmol/L為峰值；HIF-1α的mRNA水平上調(diào)在8 h為峰值，12和24 h漸減弱(P<0.05或P<0.01)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The relative mRNA expression levels of HIF-1α in the HBE cells treated with CoCl2at different concentrations. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖3不同濃度CoCl2作用HBE細(xì)胞后HIF-1αmRNA相對(duì)表達(dá)水平的變化

4 HBE細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞表型的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物顯示，與CoCl2處理的HBE細(xì)胞共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞CCL3、CD163、CD206和CCL18在8 h、12 h和24 h的熒光強(qiáng)度比率均隨CoCl2濃度增加呈上升趨勢(shì)，所有指標(biāo)數(shù)值均在800 μmol/L達(dá)峰值,與正常HBE共培養(yǎng)組比較顯著升高(P<0.05或0.01)；共培養(yǎng)8 h或12 h的巨噬細(xì)胞CCL3較CD163、CD206和CCL18熒光強(qiáng)度比率上升幅度更明顯，而共培養(yǎng)24 h的巨噬細(xì)胞CD163、CD206和CCL18較CCL3熒光強(qiáng)度比率更明顯，見(jiàn)圖4～6及表2～4。與轉(zhuǎn)染HIF-1α-Homo-488 siRNA的HBE細(xì)胞共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，其CCL3、CD163、CD206和CCL18熒光強(qiáng)度比率均較與未轉(zhuǎn)染HBE細(xì)胞共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖7及表5。

5 HBE細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬的影響

與不同濃度CoCl2處理的HBE共培養(yǎng)24 h的巨噬細(xì)胞對(duì)大腸桿菌的吞噬率在60 min前均呈不同的上升趨勢(shì)，其后吞噬率均較前降低。相對(duì)于正常HBE細(xì)胞共培養(yǎng)組，400和800 μmol CoCl2刺激組在各時(shí)點(diǎn)吞噬率均降低，其中800 μmol/L刺激組降低最明顯(P<0.01)，見(jiàn)圖8，9。

Figure 4.The expression of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells for 8 h was detected by flow cytometry. The HBE cells were pretreated with different concentrations (0, 100, 200, 400 and 800 μmol/L) of CoCl2for 24 h.

圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與經(jīng)CoCl2處理的HBE細(xì)胞共培養(yǎng)8h后巨噬細(xì)胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的表達(dá)

Figure 5.The expression of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells for 12 h was detected by flow cytometry. The HBE cells were pretreated with different concentrations (0, 100, 200, 400 and 800 μmol/L) of CoCl2for 24 h.

圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與經(jīng)CoCl2處理的HBE細(xì)胞共培養(yǎng)12h后巨噬細(xì)胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的表達(dá)

Figure 6.The expression of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells for 24 h was detected by flow cytometry. The HBE cells were pretreated with different concentrations (0, 100, 200, 400 and 800 μmol/L) of CoCl2for 24 h.

圖6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與經(jīng)CoCl2處理的HBE細(xì)胞共培養(yǎng)24h后巨噬細(xì)胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的表達(dá)

表2與經(jīng)CoCl2處理的HBE細(xì)胞共培養(yǎng)8h后巨噬細(xì)胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的熒光強(qiáng)度比率

Table 2.The fluorescence intensity ratios of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells (with CoCl2pretreatment for 24 h) for 8 h (%. Mean±SD.n=3)

GroupCCL3CD163CD206CCL18HBE+CoCl2(0 μmol/L)26.03±0.259.93±0.1511.03±0.257.87±0.42HBE+CoCl2(100 μmol/L)27.03±0.3110.07±0.1211.13±0.157.97±0.32HBE+CoCl2(200 μmol/L)28.63±0.64##10.13±0.1211.23±0.298.27±0.23HBE+CoCl2(400 μmol/L)32.10±0.40##10.37±0.06#11.63±0.15#8.83±0.25#HBE+CoCl2(800 μmol/L)33.03±0.45##10.73±0.15##12.33±0.25##9.30±0.36#

#P<0.05,##P<0.01vsHBE+CoCl2(0 μmol/L) group.

表3與經(jīng)CoCl2處理的HBE細(xì)胞共培養(yǎng)12h后巨噬細(xì)胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的熒光強(qiáng)度比率

Table 3.The fluorescence intensity ratios of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells (with CoCl2pretreatment for 24 h) for 12 h (%. Mean±SD.n=3)

GroupCCL3CD163CD206CCL18HBE+CoCl2(0 μmol/L)31.67±0.8721.97±0.5724.90±0.3016.00±0.30HBE+CoCl2(100 μmol/L)33.67±0.32#22.60±0.5024.97±0.2916.27±0.42HBE+CoCl2(200 μmol/L)34.93±0.91#23.37±0.29#25.27±0.2116.77±0.47HBE+CoCl2(400 μmol/L)36.67±0.45##23.73±0.38#25.77±0.40#17.57±0.46##HBE+CoCl2(800 μmol/L)40.00±0.26##24.43±0.32##26.53±0.49##21.03±0.12##

#P<0.05,##P<0.01vsHBE+CoCl2(0 μmol/L) group.

討 論

本研究中，我們以CoCl2刺激HBE細(xì)胞模擬COPD發(fā)病過(guò)程中通常發(fā)生的低氧刺激，發(fā)現(xiàn)與不同濃度CoCl2處理的HBE共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞吞噬率初期均呈不同的上升趨勢(shì)，相對(duì)于正常HBE細(xì)胞共培養(yǎng)組，400和800 μmol/L刺激組吞噬率降低，其中800 μmol/L刺激組降低最明顯。我們還發(fā)現(xiàn)，CoCl2刺激的HBE細(xì)胞早期主要誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物CCL3熒光強(qiáng)度比率上升；在較遲些階段主要誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物CD163、CD206和CCL18熒光強(qiáng)度比率增高；而轉(zhuǎn)染HIF-1α-Homo-488 siRNA的HBE細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞所有表型分子的誘導(dǎo)效應(yīng)明顯減弱。

表4與經(jīng)CoCl2處理的HBE細(xì)胞共培養(yǎng)24h后巨噬細(xì)胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的熒光強(qiáng)度比率

Table 4.The fluorescence intensity ratios of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells (with CoCl2pretreatment for 24 h) for 24 h (%. Mean±SD.n=3)

GroupCCL3CD163CD206CCL18HBE+CoCl2(0 μmol/L)37.83±0.3130.80±0.1733.30±0.6124.87±0.40HBE+CoCl2(100 μmol/L)38.17±0.3134.27±0.12##34.83±0.23#26.03±0.40#HBE+CoCl2(200 μmol/L)38.80±0.17##35.23±0.45##36.27±0.49##26.87±0.40##HBE+CoCl2(400 μmol/L)39.07±0.32##37.53±0.40##39.07±0.40##29.37±0.81##HBE+CoCl2(800 μmol/L)39.73±0.40##40.67±0.65##43.07±1.01##32.17±0.60##

#P<0.05,##P<0.01vsHBE+CoCl2(0 μmol/L) group.

Figure 7.The effect of HBE cells transfected with HIF-1α-Homo-488 siRNA on the expression of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages was detected by flow cytometry. The HBE cells and macrophages were co-cultured for 24 h. NC: HBE+negative control siRNA; siRNA: HBE+HIF-1α-Homo-488 siRNA; siRNA-800: HBE+HIF-1α-Homo-488 siRNA+CoCl2(800 μmol/L).

圖7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染HIF-1α-Homo-488siRNA的HBE細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18表達(dá)的影響

已報(bào)道COPD患者肺泡巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌能力減弱[1]，導(dǎo)致氣道細(xì)菌定植增加，后者促進(jìn)氣道慢性炎癥、急性加重和病情進(jìn)展；然而，巨噬細(xì)胞吞噬功能減弱的確切機(jī)制仍然不清楚。巨噬細(xì)胞吞噬能力減弱可能與環(huán)境中炎癥介質(zhì)和表型轉(zhuǎn)化有關(guān)。低氧是潛在的免疫調(diào)節(jié)劑，HIF-1α可作為免疫調(diào)節(jié)的主要因子，低氧微環(huán)境下HIF-1α的初始誘導(dǎo)激活信號(hào)級(jí)聯(lián)，增強(qiáng)殺菌活性；另一方面，HIF-1α活化又不利于全身感染，導(dǎo)致更高的死亡率[5]。最近的實(shí)驗(yàn)表明，HIF-1α也抑制氣道上皮細(xì)胞的先天性免疫應(yīng)答[6]。因此，HIF-1α的下調(diào)可以在以慢性炎癥為特征的疾病中具有治療效果。我們發(fā)現(xiàn)CoCl2濃度依賴性上調(diào)HBE細(xì)胞HIF-1α的mRNA表達(dá)水平；在8 h為峰值，其后漸減弱。將巨噬細(xì)胞與不同濃度CoCl2處理的HBE共培養(yǎng)24 h，再研究共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞對(duì)大腸桿菌的吞噬情況，我們觀察到相對(duì)于正常HBE細(xì)胞共培養(yǎng)組，400和800 μmol/L刺激組吞噬率降低，其中800 μmol/L刺激組降低最明顯，表明隨上皮細(xì)胞損傷時(shí)間延長(zhǎng)、程度加重，低氧環(huán)境的氣道上皮細(xì)胞可以減弱巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

表5與轉(zhuǎn)染HIF-1α-Homo-488siRNA的HBE細(xì)胞共培養(yǎng)24h后巨噬細(xì)胞表面CCL3、CD163、CD206和CCL18的熒光強(qiáng)度比率

Table 5.The fluorescence intensity ratios of CCL3, CD163, CD206 and CCL18 on the macrophages co-cultured with HBE cells (transfected with HIF-1α-Homo-488 siRNA) for 24 h (%. Mean±SD.n=3)

GroupCCL3CD163CD206CCL18NC35.80±0.2631.17±0.3133.83±0.7224.33±0.72siRNA21.67±0.21##17.43±0.12##20.47±0.29##14.67±0.40##siRNA-80022.50±0.10##25.83±0.49##29.20±0.52##18.60±0.44##

NC: HBE+negative control siRNA; siRNA: HBE+HIF-1α-Homo-488 siRNA488; siRNA-800: HBE+HIF-1α-Homo-488 siRNA+CoCl2(800 μmol/L).##P<0.01vsNC group.

Figure 8.The images of flow cytometric analysis for determining macrophage phagocytosis ofE.coli.

圖8巨噬細(xì)胞吞噬大腸桿菌流式細(xì)胞術(shù)直方圖

目前認(rèn)為，M1和M2巨噬細(xì)胞亞群比例失調(diào)調(diào)控氣道和肺部炎癥的發(fā)生發(fā)展。有證據(jù)表明，M1和M2巨噬細(xì)胞同時(shí)存在于COPD氣道中[7]。本研究中，我們觀察到類似現(xiàn)象，上皮細(xì)胞-巨噬細(xì)胞相互作用誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換，在整個(gè)共培養(yǎng)過(guò)程中，上皮細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞M1和M2表型標(biāo)志物均有不同的誘導(dǎo)作用；但在早期，低氧激發(fā)的上皮細(xì)胞主要誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1表型轉(zhuǎn)換，表現(xiàn)為CCL3熒光強(qiáng)度比率較CD163、CD206和CCL18上升更顯著，表明急性組織損傷誘導(dǎo)促炎性M1表型引起急性炎癥反應(yīng)。之后，相同的刺激驅(qū)使M2表型優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)換，這種現(xiàn)象與一些臨床現(xiàn)象較符合，曾有報(bào)道顯示吸煙者和COPD患者氣道管腔中M2巨噬細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，AECOPD患者支氣管BALF中M2表型和M2相關(guān)基因上調(diào)，并且重度患者比輕中度患者CD163+、CD204+和CD206+肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量和比例明顯升高[8]。M2巨噬細(xì)胞吞噬作用不足，因此，長(zhǎng)期低氧環(huán)境下，氣道上皮細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型分化的比例高于M1型，巨噬細(xì)胞吞噬能力下降，可能是導(dǎo)致COPD肺部反復(fù)感染和頻繁加重的重要原因之一。

Figure 9.The macrophage phagocytosis rate ofE.coli. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHBE+CoCl2(0 μmol/L) group.

圖9巨噬細(xì)胞對(duì)大腸桿菌的吞噬率

HIF-1α對(duì)巨噬細(xì)胞表型和功能狀態(tài)的影響仍不確定，在對(duì)肥胖機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中低氧通過(guò)HIF-1α依賴性機(jī)制誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1表型[9]；另外的研究顯示，敲除HIF-1α的巨噬細(xì)胞M2標(biāo)志物更加突出伴隨細(xì)胞毒性降低。但對(duì)腫瘤細(xì)胞或模型研究則呈現(xiàn)不同現(xiàn)象，在乳腺腫瘤PyMT轉(zhuǎn)基因模型，腫瘤細(xì)胞糖酵解的副產(chǎn)物乳酸激活HIF-1α,調(diào)控TAMs精氨酸酶1(arginase-1，Arg-1; M2標(biāo)志物之一)和誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)；特異性缺失HIF-1α的髓系細(xì)胞減弱TAMs表達(dá)Arg-1和iNOS。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，支氣管上皮細(xì)胞的HIF-1α對(duì)M1、M2標(biāo)志物均有誘導(dǎo)作用，在不同時(shí)間、不同濃度狀況下，誘導(dǎo)的程度不一樣，較高濃度、早期可能主要誘導(dǎo)M1標(biāo)志物，而低濃度、長(zhǎng)時(shí)間作用情況下，則主要誘導(dǎo)M2標(biāo)志物。當(dāng)然，HBE細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型標(biāo)志物改變也不排除其它介質(zhì)的參與。

總之，我們的結(jié)果表明，低氧作用的氣道上皮誘使巨噬細(xì)胞吞噬作用減弱和向M1和/或M2重編程。這些觀察結(jié)果有助于從氣道上皮-巨噬細(xì)胞相互作用的關(guān)系角度闡明COPD頻繁發(fā)作型患者氣道巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和功能減退的分子機(jī)制。調(diào)整氣道上皮-巨噬細(xì)胞的信息交流，改善巨噬細(xì)胞吞噬功能，調(diào)節(jié)M1/M2比例，均有助于減輕氣道炎癥并降低COPD加重的風(fēng)險(xiǎn)。