楊真禎， 朱文思， 肖 珍， 朱杰寧， 符永恒， 林秋雄， 譚虹虹， 單志新， 吳書林△

[1華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510632； 2廣東省心血管病研究所， 廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院), 廣東 廣州 510080; 3廣東省婦幼保健院， 廣東 廣州 511400]

心房顫動(atrial fibrillation, AF)又稱房顫，是臨床常見的心律失常之一?，F(xiàn)有的房顫治療策略還存在局限，不良反應(yīng)風(fēng)險發(fā)生率較高，療效不確切,遠期復(fù)發(fā)率較高[1-2]。持續(xù)的房顫可導(dǎo)致電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)，而心肌纖維化是結(jié)構(gòu)重構(gòu)的重要特征，現(xiàn)有的實驗及臨床數(shù)據(jù)表明，多種因素參與心肌纖維化及房顫的發(fā)生過程，包括氧化應(yīng)激、鈣超載、炎癥以及肌成纖維細胞的激活等[3]。心房纖維化對心律失常的維持起到關(guān)鍵作用[2, 4]。房顫患者心臟纖維化組織的含量及分布與房顫發(fā)生的機制、并發(fā)癥風(fēng)險及治療效果相關(guān)[4-5]。心肌纖維化是房顫重要的病理特征，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的過度沉積，引起心肌重構(gòu)甚至心力衰竭[6]。目前對于房顫及心肌纖維化的研究尚不深入，相關(guān)的病理生理機制仍不清楚。

微小RNA(microRNA，miRNA, miR)是在植物、動物和一些病毒中發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA，含有約22個核苷酸，通過影響靶基因mRNA穩(wěn)定性和翻譯來參與多細胞生物體中基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[7-8]。miRNA在多種基因調(diào)控途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括機體發(fā)育，造血干細胞分化，細胞凋亡，細胞增殖及器官發(fā)育等[9]。miRNA參與調(diào)控多種心血管疾病，包括冠狀動脈粥樣硬化、心肌纖維化、心力衰竭及心律失常等。例如，miR-21通過激活ERK信號通路從而促進纖維化的進展以及房顫的易感性[10]；miR-29在犬房顫心房組織以及血漿中表達降低，而膠原基質(zhì)同步增加，纖維化水平增高，而其機制主要是miR-29能阻斷轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)對膠原纖維以及細胞外基質(zhì)蛋白分泌的促進作用；此外，miR-30和miR-590均能通過纖維化參與房顫的發(fā)展[11-12]。

我們前期miRNA表達譜芯片檢測發(fā)現(xiàn)，miR-23b-3p在風(fēng)濕性心臟病伴房顫患者心耳組織中表達顯著增強，但其對心肌纖維化的作用尚不明確。本文將初步研究miR-23b-3p在人心肌成纖維細胞中對纖維化相關(guān)基因表達的調(diào)控作用，明確miR-23b-3p的作用靶基因。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoR I、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、4×SDS protein loading buffer、2×SYBR Green Mix和RNAase-free water(TaKaRa)；miR-23b-3p mimic和TGFBR3 siRNA(廣州銳博)；BCA蛋白定量試劑盒和蛋白Marker(Thermo)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(Bio-Rad)；抗GAPDH和COL3A1抗體(Protein Technology)；抗COL1A1抗體(Thermo)；抗ACTA2抗體(Abcam)；抗TGFBR3 抗體(Affinity)；PVDF膜和ECL發(fā)光液(Millipore)；DMEM/F12細胞培養(yǎng)液、特級澳洲胎牛血清和0.25% EDTA-胰蛋白酶(Gibco)；其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

2 主要方法

2.1人心房肌成纖維細胞(human atrial fibroblasts,HAFs)原代分離培養(yǎng)和處理 將經(jīng)患者知情同意的廢棄的手術(shù)切除的新鮮心耳組織(本研究經(jīng)廣東省人民醫(yī)院倫理委員會批準，手術(shù)標本來源：廣東省心血管病研究所)置于預(yù)冷的PBS緩沖液中，只剪取近心房組織，去除淤血。用0.25% EDTA-胰蛋白酶消化法分離心房肌成纖維細胞。離心棄上清，沉淀用完全培養(yǎng)液(含10 %胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液)重懸，接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，再置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，更換一次完全培養(yǎng)液。待細胞密度達90%時，消化傳代。取第3～7代細胞消化后鋪于孔板內(nèi)，分別將100 nmol/L scrambled對照、 miR-23b-3p mimic和TGFBR3 siRNA轉(zhuǎn)染到HAFs中，24 h后結(jié)束實驗。

2.2細胞免疫熒光鑒定HAFs中ACTA2表達 第3代的HAFs穩(wěn)定生長后，用預(yù)熱的PBS清洗3遍后，4%多聚甲醛室溫固定30 min，用0.2% Triton X-100透化5 min，5% BSA室溫封閉2 h，加ACTA2 Ⅰ抗(1∶500),4 ℃孵育過夜，加熒光Ⅱ抗室溫避光孵育1 h，加入含核染料DAPI的封片劑覆蓋細胞，室溫孵育5 min后激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

2.3CCK-8、EdU和Transwell實驗檢測HAFs活力、增殖和遷移能力 在96孔板中接種密度合適的HAFs，穩(wěn)定生長24 h后，分別轉(zhuǎn)染scrambled對照和miR-23b-3p mimic。24 h后每孔加入培養(yǎng)液總體積10%的CCK solution，混勻培養(yǎng)4 h后檢測450 nm處的吸光度(A)值。接種合適密度的HAFs于confocal皿中，穩(wěn)定生長后按上述分組轉(zhuǎn)染細胞，24 h后加入EdU工作液，使其終濃度為50 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，PBS清洗并用4%多聚甲醛固定后按說明書方法染色(Apollo?567染增殖細胞核)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。在Transwell小室內(nèi)接種合適密度的HAFs，穩(wěn)定生長后按上述分組轉(zhuǎn)染細胞，24 h后更換不同濃度血清的培養(yǎng)液，小室外面血清濃度高于小室內(nèi)，過夜后用PBS清洗細胞并用4%多聚甲醛室溫固定30 min，用棉簽擦除小室內(nèi)底部細胞，結(jié)晶紫染色液染小室外底部細胞20 min，顯微鏡下觀察并拍照。

2.4RT-qPCR檢測TGFBR3和纖維化標志物mRNA及miR-23b-3p的表達情況 用TRIzol法提取HAFs中總RNA。取1 μg總RNA，加入5×逆轉(zhuǎn)錄試劑4 μL(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)，用Oligo (dT)15和random primers逆轉(zhuǎn)錄出cDNA用于檢測TGFBR3及纖維化標志物的 mRNA水平,以GAPDH為內(nèi)參照。取1.0 μg總RNA，用miR-23b-3p特異的RT引物逆轉(zhuǎn)錄出cDNA用于檢測miR-23b-3p水平，以U6為內(nèi)參照。在ViiA 7 Quantitative PCR System(Applied Biosystems)進行PCR和結(jié)果分析。以2-ΔΔCt法計算TGFBR3、纖維化標志物和miR-23b-3p的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

2.5Western blot法檢測蛋白水平 處理后的HAFs中加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解，收集裂解液于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，蛋白質(zhì)定量后分裝，加入4×上樣緩沖液，99 ℃加熱10 min使蛋白質(zhì)變性，然后進行SDS-PAGE。用PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別用相應(yīng)的抗體[anti-COL1A1(1∶2 000)、anti-COL3A1(1∶2 000)、anti-ACTA2(1∶2 000)和anti-TGFBR3(1∶1 000)]4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。ECL發(fā)光試劑盒顯影，以GAPDH(1∶5 000)為內(nèi)參照，掃描灰度值并分析蛋白表達相對含量。

2.6雙螢光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C miR-23b-3p與TGFBR3 3’-UTR的結(jié)合作用 參照我們已報道方法[13]分別構(gòu)建包含miR-23b-3p潛在結(jié)合序列的TGFBR3 3’UTR重組螢光素酶報告質(zhì)粒pGL3-TGFBR3-285-292。將HEK293細胞(細胞密度約為每孔1×105)轉(zhuǎn)染1 μg重組螢光素酶報告質(zhì)粒、100 nmol/L miR-23b-3p mimic或miR-23b-3p-Mut以及20 ng pRL-TK(表達海腎螢光素酶的內(nèi)參照質(zhì)粒)。轉(zhuǎn)染后24 h，測定螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase, FL)及海腎螢光素酶(Renillaluciferase, RL)催化底物的發(fā)光強度。FL/RL的變化可反映miR-23b-3p與TGFBR3 3’UTR結(jié)合的能力。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni校正的t檢驗進行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 人心房肌成纖維細胞的分離及鑒定

原代分離的HAFs第2天觀察細胞因雜質(zhì)較多，只可見少量細胞，呈圓形，單個存在。3天后觀察，細胞伸展，細胞呈長梭形，胞核明顯。約1周后，細胞融合度達到90%，按1∶2比例傳代培養(yǎng)。本研究所用HAFs為第3～7代細胞，其成纖維細胞表型在細胞因子刺激下逐步向肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化，大量分泌細胞外基質(zhì)，ACTA2表達增多，利用細胞免疫熒光染色實驗對HAFs表達的ACTA2進行鑒定，見圖1。

2 miR-23b-3p對HAFs活力、增殖及遷移能力的影響

我們將100 nmol/L miR-23b-3p mimic轉(zhuǎn)染入HAFs中，RT-qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-23b-3p mi-mic的HAFs中miR-23b-3p水平顯著升高(P<0.01)，見圖2A。CCK-8及EdU檢測顯示，與對照組相比，HAFs過表達miR-23b-3p后，細胞活力和增殖能力無顯著差異，見圖2B、C。同樣地，Transwell檢測顯示，過表達miR-23b-3p對細胞遷移能力無明顯影響，見圖2D。

Figure 1.The morphology and identification of HAFs. A: cultured HAFs under light microscope (the scale bar=100 μm); B: expression of ACTA2 in HAFs detected by immunofluorescence staining assay (the scale bar=50 μm).

圖1人心房肌成纖維細胞的分離及ACTA2表達鑒定

Figure 2.miR-23b-3p had no significant effect on the viability, proliferation and migration of HAFs. A: the expression level of miR-23b-3p in HAFs transfected with miR-23b-3p mimic was detected by RT-qPCR; B～D: the effects of miR-23b-3p on the viability, proliferation and migration of HAFs were detected by CCK-8, EdU and Transwell assays. Scale bar=100 μm. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsscrambled group.

圖2miR-23b-3p對人心房肌成纖維細胞活力、增殖及遷移能力的影響

3 miR-23b-3p促進HAFs中纖維化相關(guān)基因的表達

RT-qPCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，HAFs過表達miR-23b-3p后，纖維化相關(guān)基因COL1A1、COL3A1和ACTA2的mRNA和蛋白表達均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，提示miR-23b-3p可在轉(zhuǎn)錄水平促進纖維化相關(guān)基因的表達，見圖3。

4 TGFBR3介導(dǎo)miR-23b-3p促進HAFs中纖維化相關(guān)基因表達

利用miRDB(www.mirdb.org)和TargetScan (www.targetscan.org)數(shù)據(jù)庫對TGFBR3及miR-23b-3p進行序列分析顯示，TGFBR3 3’UTR的285～292堿基可能是miR-23b-3p的結(jié)合位點。雙螢光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，miR-23b-3p可與TGFBR3 3’UTR的285～292位點特異性結(jié)合，而將miR-23b-3p序列突變后，miR-23b-3p-Mut不能與TGFBR3 3’UTR結(jié)合,見圖4A。RT-qPCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，過表達miR-23b-3p的HAFs中，TGFBR3的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，提示miR-23b-3p可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控TGFBR3的表達(P<0.05或P<0.01),見圖4B。在HAFs中，利用TGFBR3 siRNA沉默靶基因TGFBR3的表達以及過表達miR-23b-3p后，Western blot檢測顯示，TGFBR3 的表達均顯著降低，同時p-Smad3水平以及纖維化相關(guān)蛋白COL1A1、COL3A1和ACTA2的表達水平均一致性升高(P<0.05或P<0.01)，見圖4C。

討 論

近期研究表明，miR-23b在膿毒癥引起的心功能障礙中表達上調(diào)，miR-23b靶向抑制TGIF1，激活TGF-β1/Smad2/3信號通路，進而促進心肌成纖維細胞的分化，miR-23b還可靶向抑制PTEN，激活A(yù)KT/N-cadherin信號通路，從而導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的沉積[14]。另有研究表明，miR-23b-3p在充血性心力衰竭患者外周血中表達上調(diào)，提示miRNA可能在心力衰竭的病理過程中起作用，因為它們可能涉及與疾病進展有關(guān)的途徑，包括纖維化[15]。miR-23b-3p在心臟疾病中的發(fā)揮重要作用，但其心肌纖維中的作用機制尚未完全闡明。

在本文中，我們成功從房顫患者心耳組織中分離并培養(yǎng)HAFs，通過ACTA2免疫熒光染色證實，分離得到的細胞為表達ACTA2表型的肌成纖維細胞，適合用于纖維化表型相關(guān)的研究。鑒于心肌成纖維細胞的增殖和遷移也是心肌纖維化的重要特征[16]。我們分別通過CCK-8、EdU染色和Transwell實驗檢測HAFs的活力、增殖和遷移能力，結(jié)果顯示miR-23b-3p對HAFs的活力、增殖及遷移能力無明顯影響。進一步，通過將miR-23b-3p mimic轉(zhuǎn)染入HAFs，證實miR-23b-3p可顯著增強纖維化相關(guān)基因COL1A1、COL3A1和ACTA2表達，從而明確miR-23b-3p主要通過增強纖維化相關(guān)基因表達來發(fā)揮促進心肌纖維化的作用。

Figure 3.miR-23b-3p enhanced the expression of fibrosis-related genes in HAFs. A: the mRNA expression of COL1A1, COL3A1 and ACTA2 was determined by RT-qPCR assay; B: the fibrosis-related protein expression was determined by Western blot. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01 scrambled group.

圖3miR-23b-3p促進人心房肌成纖維細胞中纖維化相關(guān)基因表達

已有的研究報道，多種microRNA參與調(diào)控心肌纖維化過程,如miR-29a可靶向VEGF-A/MAPK信號通路，抑制心肌成纖維細胞纖維化水平及增殖[17];miR-199a-5p靶向Sirt1促進心肌成纖維細胞中心肌纖維化相關(guān)基因表達[18];miR-24可抑制心肌成纖維細胞中纖維化相關(guān)基因表達，并且降低心肌成纖維細胞的增殖及遷移能力[19];我們通過序列分析提示TGFBR3可能是miR-23b-3p的靶基因，通過雙螢光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-23b-3p與TGFBR3 3’UTR有特異性結(jié)合作用;進一步，我們證實miR-23b-3p可在mRNA和蛋白水平抑制HAFs中TGFBR3的表達，說明miR-23b-3p在轉(zhuǎn)錄水平抑制TGFBR3表達。功能實驗結(jié)果表明，miR-23b-3p和TGFBR3 siRNA可一致性地促進HAFs中纖維化相關(guān)基因表達。因此，上述結(jié)果證實TGFBR3是miR-23b-3p的靶基因，并介導(dǎo)了miR-23b-3p發(fā)揮促進HAFs中纖維化相關(guān)基因表達的作用。

TGFBR3是TGF-β超家族的共受體，介導(dǎo)TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但抑制TGF-β與TGFBR1及TGFBR2的結(jié)合作用，發(fā)揮抑制TGF-β/Smad3信號通路的作用[20]，并已被證實與多種疾病的發(fā)生相關(guān)[21-22]。研究顯示，miR-21可靶向抑制TGFBR3的表達，從而促進心肌纖維化，而過表達TGFBR3后可抑制miR-21和心肌纖維化水平[23]。在小鼠肺成纖維細胞中抑制TGFBR3的表達可加劇肺纖維化的過程[24]。本文結(jié)果表明，miR-23b-3p可抑制HAFs中TGFBR3的表達，激活Smad3信號并增強纖維化相關(guān)基因表達。本文結(jié)果與以往關(guān)于TGFBR3具有抑制心肌纖維化作用的報道一致[23, 25-26]。

Figure 4.TGFBR3 mediated the effect of miR-23b-3p on upregulation of fibrosis-related genes in HAFs. A: dual-luciferase reporter assay; B: the mRNA and protein expression of TGFBR3 in HAFs transfected with miR-23b-3p mimic; C: the protein expression of COL1A1, COL3A1, ACTA2, TGFBR3, p-Smad3 and Smad3 in HAFs after transfection with miR-23b-3p mimic orTGFBR3 siRNA (si-TGFBR3). Mean±SEM.n=3.##P<0.01vspGL3-promoter+scrambled group;*P<0.05,**P<0.01vsscrambled group.

圖4TGFBR3介導(dǎo)miR-23b-3p促進人心房肌成纖維細胞中纖維化相關(guān)基因表達

綜上所述，本文證實TGFBR3是miR-23b-3p的作用靶基因，介導(dǎo)miR-23b-3p激活HAFs中Smad3信號，發(fā)揮促進纖維化相關(guān)基因表達的作用。在后續(xù)研究中，我們將在整體動物水平進一步明確miR-23b-3p對TGFBR3表達和心肌纖維化的調(diào)控作用。