趙許朋 劉勇 魏加練

摘要：以貴長(zhǎng)獼猴桃莖段為外植體，研究不同激素組合培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化增殖、無(wú)菌苗生根等的影響。結(jié)果表明，貴長(zhǎng)獼猴桃莖段在MS+2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.4 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉8 g/L培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率相對(duì)最高，達(dá)100.0%，且愈傷組織生長(zhǎng)狀況相對(duì)較好，質(zhì)地最優(yōu)，呈黃白色濕潤(rùn)致密狀，在MS+6-BA 5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉8 g/L培養(yǎng)基上不定芽出芽率相對(duì)最高，達(dá)83.33%，在MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+GA3 0.4 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉8 g/L培養(yǎng)基上不定芽增殖率相對(duì)最高，達(dá)100%，繼代培養(yǎng)6代時(shí)的平均繁殖系數(shù)達(dá)6.48;不定芽在含IBA 0.6 mg/L的1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根率相對(duì)最高，達(dá)到95.83%，且形成龐大的根系，50株試管苗經(jīng)煉苗移栽成活率可達(dá)96.0%。

關(guān)鍵詞：貴長(zhǎng)獼猴桃;莖段;增殖;植株再生

中圖分類號(hào)： S663.404+.3 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）22-0043-04

獼猴桃為獼猴桃科獼猴桃屬（Actinidia Lindl.）多年生藤本果樹，雌雄異株，在我國(guó)發(fā)現(xiàn)最早，其種群數(shù)量、分布范圍均為世界之首，有“獼猴桃故鄉(xiāng)”之稱[1]。獼猴桃果實(shí)中含有豐富的維生素C、多種礦物質(zhì)及膳食纖維，素有“水果之王”的美譽(yù)[2]。貴長(zhǎng)獼猴桃為貴州省選育的中華獼猴桃優(yōu)良品種[3]，被國(guó)家質(zhì)檢總局認(rèn)定為國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品[4]，具有十分廣闊的研究和應(yīng)用前景。自貴長(zhǎng)獼猴桃出現(xiàn)伊始，學(xué)者們主要對(duì)其病害防治、生理特性、保鮮等方面[5-7]開展研究，而有關(guān)其組織培養(yǎng)離體再生的研究幾無(wú)報(bào)道。

組織培養(yǎng)是一項(xiàng)通過(guò)無(wú)性繁殖方式快速再生植株的生物技術(shù)，其育苗效率高于扦插嫁接等傳統(tǒng)繁殖手段，且具有保持母本優(yōu)良性狀、克服有性繁殖造成品種退化的優(yōu)勢(shì)[8-11]。組織培養(yǎng)技術(shù)是品種遺傳改良和遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)的基礎(chǔ)，從20世紀(jì)70年代開始，組織培養(yǎng)技術(shù)育苗已成為獼猴桃良種繁育的重要方法[12-13]。本研究以貴長(zhǎng)獼猴桃幼嫩莖段為外植體，通過(guò)組織培養(yǎng)對(duì)其愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織分化不定芽、無(wú)菌苗生根等進(jìn)行研究，以建立貴長(zhǎng)獼猴桃莖段高效再生體系，為其快速繁殖和遺傳轉(zhuǎn)化研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 枝條采集與消毒處理

于貴州省修文縣谷堡鄉(xiāng)獼猴桃基地采集貴長(zhǎng)獼猴桃（Actinidia chinensis cv. Guichang）幼嫩枝條，洗凈，短截成長(zhǎng)約3 cm的無(wú)腋芽莖段;75%乙醇消毒處理40 s，再用0.1%氯化汞（HgCl2）消毒處理9 min;用無(wú)菌水沖洗3～4次，切成長(zhǎng)為0.5～1.0 cm的莖段。

1.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

將消毒處理的莖段作為外植體，接種到以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、3.0 mg/L、6-芐氨基嘌呤（6-BA）質(zhì)量濃度分別為02、0.4 mg/L 不同激素組合的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)1周、光照培養(yǎng)3周，每處理接種莖段24個(gè)，重復(fù)3次，處理編號(hào)依次為A1～A6（表1）;調(diào)查愈傷組織生長(zhǎng)狀況，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.3 不定芽的誘導(dǎo)與增殖

1.3.1 不定芽的誘導(dǎo) 挑選質(zhì)地致密、生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織，接種到以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含6-BA質(zhì)量濃度分別為4.0、5.0、6.0 mg/L、萘乙酸（NAA）質(zhì)量濃度分別為0.2、0.3 mg/L 不同激素組合的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)1周、光照培養(yǎng)8周，每處理接種愈傷組織24個(gè)，重復(fù)3次，處理編號(hào)依次為B1～B6（表2）;調(diào)查統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)情況。

1.3.2 不定芽的增殖 取長(zhǎng)1 cm左右的不定芽，接種到以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含6-BA質(zhì)量濃度分別為2.0、3.0、4.0 mg/L、NAA質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0 mg/L、赤霉素（GA3）質(zhì)量濃度為 0.4 mg/L 不同激素組合的不定芽增殖培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)3周，每處理接種不定芽24個(gè)，重復(fù)3次，處理編號(hào)依次為 C1～C6（表3）;連續(xù)繼代培養(yǎng)6代，調(diào)查統(tǒng)計(jì)不定芽繁殖情況。

1.4 不定芽生根與試管苗移栽

切取長(zhǎng)約3 cm的不定芽，接種到含吲哚丁酸（IBA）質(zhì)量濃度分別為0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L的1/2 MS固體培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)2周，每處理接種不定芽24個(gè)，重復(fù)3次，處理編號(hào)依次為D1～D6（表4）;調(diào)查統(tǒng)計(jì)不定芽生根率和不定根數(shù)量。將生根情況較好的帶根苗轉(zhuǎn)入以珍珠巖為基質(zhì)的1/2 MS培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)2周，檢查根系發(fā)育狀況;打開50株組培苗的瓶蓋進(jìn)行煉苗1周，洗凈根系，移栽至裝有珍珠巖、田間土壤比例為1 ∶ 4的營(yíng)養(yǎng)缽中培養(yǎng)2周，每天適量澆水;統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

1.5 組織培養(yǎng)條件

試驗(yàn)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，培養(yǎng)基中同時(shí)加蔗糖、瓊脂粉分別為30、8 g/L，pH值為5.85。組織培養(yǎng)環(huán)境條件溫度為 （25±2） ℃，光照度4 500 lx、光照周期為16 h/d。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素組合對(duì)貴長(zhǎng)獼猴桃莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，接種后1周，莖段始膨大萌動(dòng)，接種后2周左右分化出愈傷組織（圖1-1），接種后4周莖段愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到最大。由表1可見，處理A6的愈傷組織誘導(dǎo)率相對(duì)最低，為80.2%，處理A1、A4、A5的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，高達(dá)100.0%，顯著高于其他3個(gè)處理（P<0.05），其中，愈傷組織在A5培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況相對(duì)較好，質(zhì)地最優(yōu)，呈黃白色濕潤(rùn)致密狀。因此，貴長(zhǎng)獼猴桃莖段愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為A5，即MS+2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.4 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉8 g/L。

2.2 不同激素組合對(duì)貴長(zhǎng)獼猴桃不定芽誘導(dǎo)與增殖的影響

2.2.1 不定芽的誘導(dǎo) 由表2、圖1-2、圖1-3可見，組織培養(yǎng)2周，愈傷組織開始變綠;組織培養(yǎng)7周，處理B2、B5培養(yǎng)基上最先分化出不定芽;組織培養(yǎng)9周，不定芽分化基本穩(wěn)定，處理B2的不定芽出芽率相對(duì)最高，達(dá)83.33%，顯著高于其他5個(gè)處理（P<0.05），分化出的不定芽有明顯的莖、葉分化，長(zhǎng)勢(shì)良好，其形成的平均芽數(shù)也相對(duì)最高，為7.0個(gè)，與處理B5差異不顯著（P>0.05），顯著高于其他4個(gè)處理，平均芽長(zhǎng)為1.7 cm，略短于B5培養(yǎng)基，且相互間差異不顯著。因此，貴長(zhǎng)獼猴桃不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為B2培養(yǎng)基，即 MS+6-BA 5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉8 g/L。

2.2.2 不定芽的增殖 由表3、圖1-4可見，接種不定芽培養(yǎng)1周，腋芽開始萌動(dòng)，2周左右有新的不定芽增殖;處理C2、C3的增殖效果相對(duì)最好，增殖率達(dá)100.00%，處理C1的增殖效果相對(duì)最差，增殖率為87.50%，顯著低于其他5個(gè)處理（P<0.05），說(shuō)明貴長(zhǎng)獼猴桃在一定濃度的6-BA、NAA、GA3刺激下，較易發(fā)生增殖現(xiàn)象，且增殖效果良好;培養(yǎng)后6周，新生芽出現(xiàn)簇生狀;不定芽處理C3培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)6代，其平均繁殖系數(shù)相對(duì)最高，達(dá)到6.48，顯著高于其他5個(gè)處理，且不定芽生長(zhǎng)旺盛。因此，貴長(zhǎng)獼猴桃不定芽最佳增殖培養(yǎng)基為C3培養(yǎng)基，即MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+GA3 0.4 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉8 g/L。

2.3 IBA不同濃度對(duì)貴長(zhǎng)獼猴桃不定芽生根的影響及煉苗移栽

由表4可見，接種后1周開始萌生不定根，處理D4培養(yǎng)基的生根率相對(duì)最高，為95.83%，與處理D3、D5差異不顯著（P>0.05），顯著高于其他3個(gè)處理（P<0.05），其平均生根數(shù)相對(duì)最多，為4.04條，顯著高于其他5個(gè)處理，其根平均長(zhǎng)度相對(duì)較長(zhǎng)，為0.52 cm，顯著低于處理D3，顯著高于其他4個(gè)處理。將處理D4的生根不定芽轉(zhuǎn)入含1/2 MS液體培養(yǎng)基的珍珠巖基質(zhì)中進(jìn)行根系增殖，結(jié)果顯示，無(wú)菌苗生長(zhǎng)旺盛，根的長(zhǎng)度增長(zhǎng)、數(shù)量明顯增加，且有側(cè)根增生，培養(yǎng)2周左右時(shí)形成龐大的根系，有利于試管苗移栽成活（圖1-5）。50株試管苗煉苗移栽成活48株，成活率達(dá)到96.0%，且生長(zhǎng)良好（圖1-6）。因此，貴長(zhǎng)獼猴桃不定芽生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+IBA 0.6 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉8 g/L。

3 結(jié)論與討論

獼猴桃組織培養(yǎng)是學(xué)者們研究的一個(gè)熱點(diǎn)，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)研究貴長(zhǎng)獼猴桃莖段組織培養(yǎng)離體再生時(shí)發(fā)現(xiàn)，莖段在MS+2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.4 mg/L+ 蔗糖30 g/L+瓊脂粉8 g/L培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率相對(duì)最高，達(dá)100.0%，且誘導(dǎo)出的愈傷組織生長(zhǎng)良好，與Kim等的研究結(jié)果[14-15]一致。

愈傷組織分化成不定芽是組織培養(yǎng)的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，更是一個(gè)難點(diǎn)，有些植物因無(wú)法從愈傷組織分化成不定芽而阻礙了其再生體系的建立[16]。在獼猴桃組織培養(yǎng)過(guò)程中，常用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有玉米素（ZT）和6-芐氨基嘌呤（6-BA），且ZT效果要優(yōu)于6-BA[17-18]，但是，玉米素價(jià)格昂貴，必然會(huì)明顯增加組織培養(yǎng)的成本，而目前有6-BA代替玉米素完成獼猴桃愈傷組織分化不定芽過(guò)程的研究報(bào)道[19-20]。本試驗(yàn)在誘導(dǎo)愈傷組織形成不定芽時(shí)采用6-BA與NAA配合使用，取得了良好的效果，不定芽出芽率高達(dá)83.33%，平均出芽數(shù)可達(dá)到7.0個(gè)，與隆前進(jìn)等的研究結(jié)果[21-22]吻合。須說(shuō)明的是，本研究中，不同激素配比雖然能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，但有的激素組合會(huì)導(dǎo)致不定芽頂芽萎縮、葉片膨大形成畸形苗且發(fā)育較差等現(xiàn)象產(chǎn)生。

對(duì)不定芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)以產(chǎn)生新的不定芽，這是提高試管苗數(shù)量的基礎(chǔ)。在研究不定芽增殖過(guò)程中，學(xué)者們多對(duì)不定芽的第1代增殖系數(shù)進(jìn)行研究[9，12，23-24]，鮮見對(duì)不定芽連續(xù)繼代培養(yǎng)的研究[1]。嚴(yán)姜黎等分別對(duì)紅肉獼猴桃、紅陽(yáng)獼猴桃、美味獼猴桃不定芽1代增殖培養(yǎng)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，其增殖系數(shù)分別為3.7、5.2、4.8[12，21，23]。本研究對(duì)貴長(zhǎng)獼猴桃不定芽繼代培養(yǎng)1～6代增殖系數(shù)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，不定芽在MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+GA3 0.4 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉8 g/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)可獲得較高的增殖系數(shù)，達(dá)到6.48，且各代不定芽增殖系數(shù)相對(duì)穩(wěn)定。

不定芽生根培養(yǎng)是形成離體再生植株的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，生根的數(shù)量和質(zhì)量決定煉苗移栽的成活率[25-27]。本研究將不定芽在含IBA的1/2MS固體培養(yǎng)基上刺激生根，再轉(zhuǎn)入以珍珠巖為基質(zhì)的1/2 MS壯根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根，取得了良好的生根效果，經(jīng)過(guò)增殖培養(yǎng)，無(wú)菌苗根的長(zhǎng)度延長(zhǎng)、數(shù)量明顯增加，且伴有側(cè)根的增殖，2周左右形成龐大的根系，同時(shí)，將其煉苗移栽至裝有珍珠巖、田間土壤比例為1 ∶ 4的營(yíng)養(yǎng)缽中，移栽成活率達(dá)到96.0%。

本研究以2，4-D、6-BA、NAA、GA3等為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，形成了貴長(zhǎng)獼猴桃莖段的高效再生體系，為貴長(zhǎng)獼猴桃試管苗的工廠化生產(chǎn)和基因工程育種打下了基礎(chǔ)。

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