尤 潤(rùn)，王玲玲，曹璐瑤，廖文軒，邢夢(mèng)雪，王文秀，鐘麗萍，鄭麗麗，肖祖飛*

（南昌工程學(xué)院水利與生態(tài)工程學(xué)院，江西南昌 330099）

華木蓮（Sinomanglietia glauca）是1988年在江西省宜春明月山首次發(fā)現(xiàn)，1994年俞志雄發(fā)表該樹種，并建立華木蓮屬[1]。華木蓮，木蘭科落葉喬木，樹干通直，樹形優(yōu)美，花香沁人心脾近乎幽蘭，花色淡黃典雅宛若睡蓮，金秋碩果累累，分布于江西和湖南個(gè)別地方，是我國(guó)特有珍稀瀕危樹種，也是優(yōu)良的園林綠化樹[2]。以華木蓮一年生半木質(zhì)化枝條為材料，研究消毒時(shí)間、基本培養(yǎng)基和激素對(duì)華木蓮莖段組織培養(yǎng)的影響，旨在為更好保護(hù)、開發(fā)與利用瀕危物種華木蓮。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料來自南昌工程學(xué)院木蘭園的華木蓮。2015年6 月份選取生長(zhǎng)健壯的華木蓮植株，剪取當(dāng)年生半木質(zhì)化枝條，將枝條修剪成帶1～2 個(gè)芽的莖段，待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 消毒時(shí)間對(duì)華木蓮莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響。將修剪好的莖段放入無菌罐頭瓶，75%酒精中浸泡30s，用無菌水沖洗3～5 次，用0.1%的氯化汞（HgCl2）進(jìn)行消毒，消毒時(shí)間分別為5、6、7、9 和12min，用無菌水沖洗3～5次，莖段放在無菌濾紙上吸干表面水分，接種在MS+1.5mg/L6-BA+0.2mg/LIBA 培養(yǎng)基，每個(gè)處理30 瓶，每瓶1～2 個(gè)莖段。

1.2.2 基本培養(yǎng)基對(duì)華木蓮莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響。將修剪好的莖段放入無菌罐頭瓶，75%酒精中浸泡30s，用無菌水沖洗3～5 次，再用0.1%的氯化汞進(jìn)行消毒7min，用無菌水沖洗3～5 次，莖段放在無菌濾紙上吸干表面水分，接種在DCR 和MS 基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基添加1.5mg/L6-BA+0.2mg/LIBA。每個(gè)處理60 瓶，每瓶1～2 個(gè)莖段。

1.2.3 激素濃度對(duì)華木蓮莖段萌芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響。將修剪好的莖段放入無菌罐頭瓶，75%酒精中浸泡30s，用無菌水沖洗3～5 次，再用0.1%的氯化汞進(jìn)行消毒，消毒時(shí)間分別為7min，用無菌水沖洗3～5 次，莖段放在無菌濾紙上吸干表面水分，接種在MS 培養(yǎng)基，添加6-BA（0.5mg/L、1.00mg/L、1.50mg/L、2.00mg/L、3.00 mg/L），IBA （0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L）。每個(gè)處理20 瓶，每瓶1～2 個(gè)莖段。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入、整理和方差分析。主要調(diào)查指標(biāo)如下：存活率（%）=（存活的外植體數(shù)／接種的外植體數(shù)）×100；污染率（%）=（污染的外植體數(shù)／接種的外植體數(shù)）×100；褐化率（%）=（褐化的外植體數(shù)／接種的外植體數(shù)）×100；萌芽率（%）=（萌芽的外植體數(shù)／接種的外植體數(shù)）×100；愈傷率（%）=（誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)／接種的外植體數(shù)）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時(shí)間對(duì)華木蓮莖段培養(yǎng)的影響

由表1 和圖1 可知，隨著消毒時(shí)間的增加，華木蓮莖段組織培養(yǎng)污染率逐漸降低，華木蓮莖段消毒5min，污染率超過50%，與消毒6min 差異不顯著，顯著高于消毒7min、9min 和12min，消毒9min 和12min，污染率均低于20%。隨著消毒時(shí)間的增加，褐化率逐漸升高，華木蓮莖段消毒5min 和6min，褐化率較低，低于10%，之間差異不顯著；消毒7min，褐化率較低，為15.63%；消毒時(shí)間超過9min，褐化率顯著提高，顯著高于5min、6min 和7min。隨著消毒時(shí)間的增加，存活率和萌芽率呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)。消毒7min，存活率和萌芽率達(dá)到最大值，分別為31.25%和20.63%，顯著高于其它消毒時(shí)間。因此，華木蓮莖段組織培養(yǎng)消毒最佳時(shí)間為7min。

表1 消毒時(shí)間對(duì)華木蓮莖段培養(yǎng)的影響

2.2 基本培養(yǎng)基對(duì)華木蓮莖段培養(yǎng)的影響

圖1 華木蓮莖段組織培養(yǎng)，由左至右依次為莖段萌芽、污染和褐化

選擇適當(dāng)?shù)幕九囵B(yǎng)基，對(duì)于組織培養(yǎng)成功至關(guān)重要。由表2 可知，華木蓮莖段組織培養(yǎng)采用MS 培養(yǎng)基褐化率低于DCR 培養(yǎng)基，存活率、愈傷率和萌芽率高于DCR 培養(yǎng)基，之間差異顯著。采用MS 培養(yǎng)基，莖段容易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織（圖2），腋芽萌芽也較快。因此，華木蓮莖段組織培養(yǎng)適宜基本培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基。

2.3 不同激素濃度對(duì)華木蓮莖段培養(yǎng)的影響

表2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)華木蓮莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

圖2 不同基本培養(yǎng)基對(duì)華木蓮莖段培養(yǎng)的影響左圖為MS 培養(yǎng)基，右圖為DCR 培養(yǎng)基

由表3 可知，在IBA 濃度不變的情況下，隨著6-BA 濃度的增加，華木蓮莖段的萌芽率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。處理3 和處理5，華木蓮莖段萌芽率最高，分別為26.50%和28.67%，之間差異不顯著，顯著高于其它處理，處理3 腋芽萌芽較快，芽粗壯，葉片舒展，切口有較多愈傷組織形成，而處理5 可能6-BA 濃度過高，芽、葉片呈水漬狀；其次是處理4，萌芽率為23.67%；萌芽率較低的是處理1 和處理2，萌芽率分別為9.33%和15.28%。在6-BA 濃度不變，華木蓮莖段的萌芽率隨著IBA 濃度的增加呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，處理7 誘導(dǎo)腋芽萌芽率最高，為29.83%，顯著高于其它處理，且腋芽萌芽快，芽粗壯，切口愈傷組織較多。因此，華木蓮莖段誘導(dǎo)腋芽萌芽最適激素配比為MS +1.5mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L IBA。

繼代培養(yǎng)結(jié)果表明，華木蓮難以誘導(dǎo)芽的增殖（圖3），可能與自身的遺傳因素有關(guān)。

表3 激素配比對(duì)華木蓮莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

3 討論與結(jié)論

圖3 華木蓮莖段繼代培養(yǎng)的影響

組織培養(yǎng)具有操作簡(jiǎn)單、繁殖系數(shù)高、脫毒、可周年生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，可以在短期內(nèi)獲得大規(guī)模苗木，滿足市場(chǎng)需求，是木本植物快速、高效無性繁殖的主要方式。影響植物組織培養(yǎng)的因素較多，如基因型、取材時(shí)間、消毒時(shí)間、培養(yǎng)基、激素等。外植體消毒時(shí)間太短，外植體消毒不干凈，污染率高；消毒時(shí)間太長(zhǎng)，污染率低，但對(duì)外植體殺傷力大，褐化嚴(yán)重。本研究結(jié)果表明，華木蓮半木質(zhì)化莖段組織培養(yǎng)消毒最佳時(shí)間為7min，褐化率低，存活率和萌芽率達(dá)到最大值，分別為31.25%和20.63%。

植物組織培養(yǎng)采用較多的基本培養(yǎng)基是MS、White、DCR 等培養(yǎng)基，根據(jù)研究目的的不同進(jìn)行調(diào)整。吳金壽[3]等研究表明，樟樹莖段接入不同培養(yǎng)基培養(yǎng)，以改良MS 為基本培養(yǎng)基的組合誘導(dǎo)不定芽數(shù)量最多，苗況較好未見褐變；而以MS 為基本培養(yǎng)基的組合有褐變現(xiàn)象；以1/2MS 為基本培養(yǎng)基的組合不定芽誘導(dǎo)系數(shù)最低，且莖葉變?yōu)闂椉t色。吳幼媚[4]等在MS培養(yǎng)基中加入Ca（NO3）2，能夠較好地誘導(dǎo)初始芽的形成，減輕芽的褐化程度，促進(jìn)芽正常生長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明，華木蓮莖段組織培養(yǎng)采用MS 培養(yǎng)基褐化率低于DCR 培養(yǎng)基，存活率、愈傷率和萌芽率高于DCR 培養(yǎng)基，且采用MS 培養(yǎng)基，莖段容易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，腋芽萌芽也較快。因此，華木蓮莖段組織培養(yǎng)適宜基本培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基。

外源激素是植物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因子，在外植體的誘導(dǎo)、不定芽的分化與增值及芽苗生根培養(yǎng)過程中，外源激素發(fā)揮重要的作用。長(zhǎng)期以來，對(duì)激素的研究一直停留在憑經(jīng)驗(yàn)摸索的基礎(chǔ)上，對(duì)于同一植物，所用激素種類和濃度說法不一。BA、NAA 和IBA 是植物組織培養(yǎng)中應(yīng)用最廣的激素。辜夕容[5]等研究表明高濃度的6-BA 對(duì)香樟莖段上隱芽的萌動(dòng)與伸長(zhǎng)有利，而低濃度6-BA 有利于愈傷組織的生長(zhǎng)；NAA 濃度越高，香樟莖段上愈傷組織長(zhǎng)得越好，但過低或過高則不利于香樟莖段隱芽的萌動(dòng)與伸長(zhǎng)，NAA 為0.05mg/L時(shí)，腋芽才長(zhǎng)得最好；同時(shí)6-BA 與NAA 的比值對(duì)香樟莖段上隱芽的萌動(dòng)與伸長(zhǎng)及愈傷組織的生長(zhǎng)有較大影響，6-BA/NAA 為40 時(shí)，萌出的腋芽最長(zhǎng)，較低配比則有利于促進(jìn)愈傷組織的形成。本研究結(jié)果表明，誘導(dǎo)華木蓮莖段腋芽萌芽的適宜激素配比MS+1.5mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L IBA，腋芽萌芽較快，芽粗壯，葉片舒展，切口有較多愈傷組織形成。華木蓮芽的繼代培養(yǎng)難以增殖，可能是因?yàn)槿A木蓮在遺傳存在嚴(yán)重退化，這與龍桂根等[6]、劉素梅等[7]研究一致。