張小林，黃 晨，靳向煜

(1. 江南大學(xué) 紡織服裝學(xué)院，江蘇 無錫 214122； 2. 東華大學(xué) 紡織學(xué)院，上海 201620)

海藻酸是從天然海藻中提取的一種線形多糖生物高分子材料，由β-D-甘露糖醛酸(M 單元)和α-L-古羅糖醛酸(G單元)兩種組份組成，以M-M、G-G、M-G 等多種形式排列，是通過1～4糖苷鍵連接而成的嵌段聚合物[1]。海藻酸因具有高生物相容性、無毒性等優(yōu)良性能，被廣泛用于傷口敷料、藥物釋放及組織工程等領(lǐng)域。海藻酸大分子結(jié)構(gòu)中G單元與Ca2+交聯(lián)形成特殊的“egg-box”結(jié)構(gòu)[2]，且相交聯(lián)的Ca2+可與Na+和K+發(fā)生離子交換，形成水溶性的海藻酸鹽。海藻酸鈣纖維敷料用于創(chuàng)面治療時，通過離子交換，從不溶性海藻酸鈣轉(zhuǎn)變成水溶性海藻酸鈉，吸收大量液體呈凝膠狀態(tài)，為傷口愈合提供相對安全潤濕的環(huán)境[3]。尤其治療洞穿性創(chuàng)面時，成凝膠性能可減少死腔，緩解病人疼痛癥狀，效果明顯[4]。

國內(nèi)外已展開對海藻酸鹽纖維[5-7]的研究。文獻(xiàn)[8]對海藻酸鈣纖維基本性能，如表觀形貌，物理參數(shù)及熱、力學(xué)性能等進(jìn)行了初步研究及表征。文獻(xiàn)[1]研究制備高強(qiáng)度海藻酸鹽纖維，并得出濕法紡絲的最佳工藝參數(shù)，同時表征纖維基本性能。文獻(xiàn)[9-10]研究海藻酸鹽纖維降解機(jī)理及影響降解性能因素，并對材料降解性能、力學(xué)性能、藥物釋放及抗菌性能作詳細(xì)闡述。文獻(xiàn)[11-13]以海藻酸為原料紡制微膠囊，將其作為藥物載體，并植入動物體內(nèi)做進(jìn)一步病理學(xué)分析。文獻(xiàn)[14]將不同相對分子質(zhì)量的海藻酸鈉高分子原料混合，控制相對分子質(zhì)量大小來調(diào)節(jié)海藻酸鹽凝膠的力學(xué)性能。目前主要以靜電紡、濕法紡絲和凍干法制備海藻酸鹽纖維支架等。

本文以海藻酸為主要原料并添加其他物質(zhì)，通過微流紡紡制新型海藻酸鹽復(fù)合纖維敷料，并對其降解性能、力學(xué)性能及生物毒性作評價，為后期用于傷口創(chuàng)面治療提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

海藻酸鈉(180947-100G，Sigma)；殼聚糖(Hyclone-SH30256，國藥)；羥基磷灰石(C10068615，麥克林)；氯化鈣(AR500ML，凌峰試劑)；乙醇(AR500ML，鴻盛)；去離子水；胰蛋白酶(0.25%，加拿大)；細(xì)胞培養(yǎng)液；磷酸緩沖液PBS(Hyclone-SH30256，國藥)；噻唑藍(lán)(MTT，美國)；二甲基亞砜(DMSO，美國)；人的成纖維皮膚細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞。

1.2 試驗儀器

掃描電子顯微鏡(S-4800型，日本)；高強(qiáng)高模纖維強(qiáng)伸度儀(XQ-1C型，上海新纖儀器公司)；18 kW轉(zhuǎn)靶X射線衍射儀(D/max-2550VB-PC型，日本)；紅外光譜儀(Nicolet 6700型，美國)；酶標(biāo)儀(Synergy H1型，美國)；倒置顯微鏡(LEICA DMi1型，美國)。

1.3 海藻酸鹽基纖維敷料制備方法

將海藻酸鈉粉末溶于去離子水中，制備體積分?jǐn)?shù)為3%的海藻酸鈉溶液3份，并標(biāo)為A、 B、 C。往A溶液中加入0.1 mg殼聚糖粉末，B溶液中加入0.1 mg羥基磷灰石粉末。已配制的海藻酸鈉溶液A、 B、 C分別為芯層溶液，皮層溶液均為5%氯化鈣乙醇溶液，通過自制微流紡設(shè)備[9]紡制3種類型海藻酸鹽基纖維敷料，如表1所示。

表1 3種纖維芯-鞘流成分Table 1 Core-sheath ingredient of three kinds of fiber

1.4 海藻酸鹽基纖維敷料性能測試

1.4.1 表面形態(tài)表征

先使用手感目測法對纖維敷料的外觀形態(tài)進(jìn)行感官評價，然后采用掃描電子顯微鏡對纖維表面形態(tài)做進(jìn)一步觀察。

1.4.2 溶脹性能

室溫下將3種纖維敷料分別浸漬在磷酸鹽緩沖液中，在固定時間間隔取出樣品，用濾紙充分吸除纖維表面多余水分并稱量，用溶脹率(式(1))來表示纖維溶脹性能。

溶脹率=[(ms-mi)/mi]×100%

(1)

式中：ms為纖維敷料溶脹后質(zhì)量；mi為纖維敷料未溶脹前質(zhì)量。

1.4.3 降解性能

室溫下將3種纖維敷料分別浸漬在磷酸鹽緩沖液中，在固定時間間隔取出樣品，充分脫水干燥并稱量，用質(zhì)量損失率(式(2))來表示纖維降解性能。

我國設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣的另一重要問題是缺乏資金的支持。設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)的推廣需要大量資金，設(shè)施農(nóng)業(yè)在全國范圍內(nèi)推廣效果欠佳，根本原因是農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新度不夠以及國內(nèi)農(nóng)業(yè)全面機(jī)械化需要不斷的資金支持。由于地方和國家的財政部門對于技術(shù)推廣沒有足夠的重視程度，在國家財政預(yù)算中未能將設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣納入其中，導(dǎo)致技術(shù)推廣資金支持不足。

質(zhì)量損失率=[(m0-m1)/m0]×100%

(2)

式中：m0為纖維敷料未浸漬前質(zhì)量；m1為纖維敷料降解后質(zhì)量。

1.4.4 紅外光譜及X-射線衍射分析

采用紅外光譜儀對纖維的光能團(tuán)進(jìn)行測試分析，采用X-射線衍射儀測定海藻酸鹽纖維的結(jié)晶度。

1.4.5 力學(xué)性能測試

在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境(溫度為(20±3)℃，相對濕度為(65±5)%)下，使用高強(qiáng)高模纖維強(qiáng)伸度儀對纖維的力學(xué)性能進(jìn)行測試，拉伸隔距為10 mm，預(yù)加張力為0.5 cN，拉伸速度為20 mm/min。

1.4.6 生物毒性評價

(1) 細(xì)胞增殖試驗。3種纖維敷料各取50 mg分別浸漬在50 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，放置在恒溫箱中孵化5 d，過濾所制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的纖維浸提液。分別將人體皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞按照5 000個/孔的濃度加入到96孔板中，在37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。每孔加入100 μL試樣液，空白組加入等體積培養(yǎng)基。在固定時間間隔內(nèi)，每孔加入10 μL MTT培養(yǎng)3.5 h。用移液槍吸去孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL DMSO，于490 nm 測定吸光度[15-16]。細(xì)胞相對增殖率(RGR)=樣品吸光度/空白組吸光度×100%。

(2) 細(xì)胞劃痕試驗。人體皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞按照1×106個/孔的濃度接種到3 cm培養(yǎng)板，在37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長到90%后，用20 μL吸液管分別在培養(yǎng)板中劃痕，用移液槍吸去培養(yǎng)基，加入3 mL試樣液，空白對照組加入等體積培養(yǎng)基。在固定時間間隔內(nèi)取出培養(yǎng)板，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞遷移情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸鹽基纖維敷料的表面形貌特征

(a) SA

(b) SA-CS

(c) SA-HAP圖1 海藻酸鹽基纖維敷料的表面形態(tài)Fig.1 Morphological characterization of alginate-based fibrous dressings

2.2 海藻酸鹽基纖維敷料的溶脹性能和降解性能

3種海藻酸鹽基纖維敷料的溶脹性能和降解性能如圖2所示。

(a) 溶脹性能

(b) 降解性能圖2 3種海藻酸鹽基纖維敷料的溶脹性能和降解性Fig.2 Swelling behavior and degradation of threetypes of alginate-based fibrous dressings

由圖2(a)可知，海藻酸鹽纖維呈現(xiàn)優(yōu)異的溶脹性能，歸因于纖維中含有大量的—OH和—COOH。纖維浸漬在磷酸鹽緩沖液中，海藻酸鹽纖維中β-D-甘露糖醛酸(M)大分子基團(tuán)先吸收大量水分，當(dāng)達(dá)到飽和狀態(tài)時，纖維發(fā)生部分降解；此時α-L-古羅糖醛酸(G)大分子基團(tuán)“egg-box”結(jié)構(gòu)中與—COOH 交聯(lián)的Ca2+和溶液中Na+/K+發(fā)生離子交換，吸收更多的水分，最終導(dǎo)致“egg-box”結(jié)構(gòu)破裂，大量的水分子進(jìn)入到大分子鏈中，導(dǎo)致纖維降解[9]。由圖2可知，海藻酸鹽-殼聚糖復(fù)合纖維及海藻酸鹽-羥基磷灰石復(fù)合纖維的溶脹和降解性能均差于海藻酸鹽纖維。羥基磷灰石嵌入并均勻覆蓋在纖維表面，降低水分子浸入纖維內(nèi)部的趨勢，減弱纖維溶脹性能，進(jìn)而減緩纖維降解過程。殼聚糖是一種線性陽離子聚合物，殼聚糖大分子鏈中的—NH2和海藻酸鈣中的—COOH存在靜電作用，可以減少海藻酸中—COOH與Ca2+的交聯(lián)，降低了離子交換程度，導(dǎo)致海藻酸鹽-殼聚糖復(fù)合纖維呈現(xiàn)較低的溶脹及降解性能[9]。

2.3 海藻酸鹽基纖維敷料的力學(xué)性能

3種海藻酸鹽基纖維敷料的力學(xué)性能隨降解時間的變化如圖3所示。

(a) 斷裂伸長率

(b) 斷裂強(qiáng)度圖3 3種海藻酸鹽基纖維敷料的力學(xué)性能隨降解時間變化Fig.3 Mechanical performance of three types of alginate-basedfibrous dressings changes with degradation time

由圖3可知，3種纖維敷料的斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率均隨著降解時間增加而減小。降解速度越快，纖維敷料斷裂強(qiáng)度損耗越大，3種纖維敷料斷裂強(qiáng)度對應(yīng)于其降解速度。羥基磷灰石覆蓋在纖維敷料表面，使纖維敷料剛度增強(qiáng)，導(dǎo)致海藻酸鹽-羥基磷灰石復(fù)合纖維敷料呈現(xiàn)最小斷裂伸長率；殼聚糖大分子鏈中—NH2與海藻酸鹽大分子鏈中的—COOH相交聯(lián)，減少了—COOH與Ca2+交聯(lián)，增加了纖維敷料柔度，導(dǎo)致海藻酸鹽-殼聚糖復(fù)合纖維敷料比海藻酸鹽纖維敷料呈現(xiàn)更大的斷裂伸長率。

2.4 海藻酸鹽基纖維敷料的紅外光譜及X-射線衍射分析

3種海藻酸鹽基纖維敷料的紅外光譜和X-射線衍射光譜如圖4所示。

(a) 紅外光譜

(b) X-射線衍射光譜圖4 3種海藻酸鹽基纖維敷料的紅外光譜和X-射線衍射光譜Fig.4 FTIR spectra and XRD patterns of three types ofalginate-based fibrous dressings

2.5 細(xì)胞增殖試驗

醫(yī)用海藻酸鹽基纖維敷料的生物毒性評價極其重要，本試驗采用人體皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞，通過細(xì)胞增殖試驗和遷移試驗對纖維敷料的細(xì)胞毒性進(jìn)行評價。3種纖維敷料浸提液處理的人體成纖維細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞增殖試驗結(jié)果分別如圖5和6所示，其中Control為空白對照組。由圖5和6可知，試驗組中的OD 490值均大于對照組。由此可知，經(jīng)3種纖維敷料浸提液處理過的人體皮膚細(xì)胞存活率和對照組相當(dāng)，或略大于對照組。另外，海藻酸鹽纖維敷料、海藻酸鹽-殼聚糖復(fù)合纖維敷料及海藻酸鹽-羥基磷灰石復(fù)合纖維敷料對應(yīng)的人體成纖維細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞的相對增長率均大于75%，根據(jù)細(xì)胞毒性評級標(biāo)準(zhǔn)[15-16](如表2所示)可證明材料無生物毒性。

(a) 細(xì)胞增殖

(b) 細(xì)胞相對增長率圖5 3種纖維敷料浸提液處理的人體皮膚成纖維細(xì)胞增殖試驗結(jié)果Fig.5 Results of fibroblasts proliferation treatedby three types of fibrous dressings extracted medium

(a) 細(xì)胞增殖

(b) 細(xì)胞相對增長率圖6 3種纖維敷料浸提液處理的人體皮膚角質(zhì)化細(xì)胞增殖試驗結(jié)果Fig.6 Results of keratinocytes proliferation treatedby three types of fibrous dressings extracted medium

表2 細(xì)胞毒性評級標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Cytotoxicity grading criteria

(續(xù) 表)

2.6 細(xì)胞遷移試驗

體外模擬人工劃痕試驗用于表征材料對細(xì)胞遷移性能影響，以進(jìn)一步評價材料對細(xì)胞的毒性。3種纖維敷料對人體皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞遷移性能影響如圖7和圖8所示，其中Control為空白對照組。由圖7可知，經(jīng)3種纖維敷料浸提液處理過的劃痕，24 h后已長滿90%，與空白對照組中的細(xì)胞遷移速率基本相同。由圖8可知，經(jīng)試驗組和對照組浸提液處理的劃痕，72 h后長滿90%。人工模擬細(xì)胞劃痕試驗表明，海藻酸鹽-殼聚糖復(fù)合纖維敷料及海藻酸鹽-羥基磷灰石復(fù)合纖維敷料對人體皮膚細(xì)胞沒有明顯細(xì)胞毒性，相比空白對照組而言，試驗組浸提液處理過的細(xì)胞遷移速率基本相同。

(a) 0 h

(b) 12 h

(c) 24 h圖7 3種纖維敷料浸提液處理過的人體皮膚成纖維細(xì)胞劃痕試驗結(jié)果Fig.7 Results of fibroblast migration in the scratched fibroblast free area after treated bythree types of fibrous dressings extracted medium

(a) 0 h

(b) 24 h

(c) 72 h圖8 3種纖維敷料浸提液處理過的人體皮膚角質(zhì)化細(xì)胞劃痕試驗結(jié)果Fig.8 Results of keratinocyte migration in the scratched keratinocyte free area after treated by threetypes of fibrous dressings extracted medium

3 結(jié) 語

本文采用自制微流紡絲設(shè)備制備3種海藻酸鹽基纖維敷料，并通過溶脹率、質(zhì)量損失率和力學(xué)性能等測試，結(jié)果表明，海藻酸鹽-殼聚糖復(fù)合纖維敷料和海藻酸鹽-羥基磷灰石復(fù)合纖維敷料比純海藻酸鹽纖維敷料具有更慢降解速率及更強(qiáng)力學(xué)性能。由此表明，芯層流中殼聚糖或羥基磷灰石顆粒的加入可延緩纖維敷料降解周期，增強(qiáng)纖維敷料力學(xué)性能。另外，人體皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞增殖試驗及遷移試驗結(jié)果表明，3種復(fù)合纖維敷料均無細(xì)胞毒性，可為后期治療傷口創(chuàng)面提供理論參考依據(jù)。