李倩珺，胡藝琳，梁 琰，王 婷，吳曉賓，晁 艷△

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，廣東廣州 510120；2.深圳市婦幼保健院，廣東深圳 518028；3.廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，廣東廣州 510120。)

宮頸癌是女性生殖器官腫瘤中最常見的腫瘤之一，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染是目前認為導致宮頸癌最主要的因素[1-2]。當今宮頸癌的治療手段包括手術，放、化療等，但這些措施均存在一定的弊端，如出現(xiàn)機體免疫功能下降，反生并發(fā)癥，甚至死亡等[3]。近年來，中醫(yī)藥在抗病毒及抗腫瘤方面的作用日益引起關注，但其發(fā)揮作用的機制尚不明了[4-5]。純中藥栓劑保婦康栓由莪術油和冰片2味中藥組成，可活血化瘀、清熱解毒、去腐生肌，常用于治療宮頸HPV感染。保婦康栓可改善局部免疫微環(huán)境并消除HPV感染，降低了高危型HPV感染患者向?qū)m頸進展的危險性[6-7]。因此，本研究通過制備保婦康栓含藥血清并作用于HPV16陽性人宮頸鱗癌細胞系SiHa細胞，觀察細胞體外增殖及凋亡情況，旨在為臨床應用中藥預防并治療HPV感染提供重要的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑 細胞培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，二甲基亞砜購自上海華舜產(chǎn)品，青霉素和鏈霉素購自華北制藥廠，胰酶及乙二胺四乙酸購自SERVA公司及賽多利斯公司，CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術研究所，核糖核酸酶和聚酰亞胺購自Sigma公司。

1.2藥物 保婦康栓主要成分為莪術油及冰片制成的溶液購自海南碧凱藥業(yè)有限公司。重組人干擾素α-2b 水針劑購自安徽安科生物工程股份有限公司。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 選用細胞系為HPV16陽性人宮頸鱗癌細胞系SiHa，培養(yǎng)條件為于胎牛血清10%、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL，DMEM培養(yǎng)基，5%CO2、溫度37 ℃及飽和濕度。

1.3.2含藥血清的提取 選取雌性SD大鼠60只,平均體質(zhì)量(200±30)g，隨機分為中藥組(保婦康栓組)、陽性對照組(干擾素組)和陰性對照組。每組每天灌胃給藥1次，連續(xù)7 d，陽性對照組肌肉注射給藥5 d。給藥劑量為人臨床給藥等效劑量的10倍(200 g體質(zhì)量大鼠給藥劑量=60 kg體質(zhì)量人給藥劑量×0.018×100)。中藥在末次給藥后1 h，西藥在肌肉注射后40 min，腹主動脈采血，血樣于37 ℃水浴30 min，3 000 r/min離心10 min，吸取血清后滅活(56 ℃水浴30 min)并除菌(0.22 μm微孔濾膜過濾)，分裝于1 mL無菌EP管備用。

1.3.3CCK-8比色法觀察藥物對SiHa細胞的生長抑制作用 取數(shù)生長期細胞，胰酶消化離心后進行細胞計數(shù)(1 × 104個/mL)，接種于96孔培養(yǎng)板 (每孔100 μL)，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞貼壁后加入8%含藥血清培養(yǎng)基(設6個平等對照孔)，使終體積為200 μL，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48、72 h后加入20 μL CCK-8試劑，混勻，酶標儀測定每孔吸光度(OD值)。

1.3.4流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡 每孔2 mL細胞懸液(2×105個/孔)加入6孔板中；置37 ℃培養(yǎng)箱24 h后加入8%含藥血清培養(yǎng)基(100 μL/孔)，同時設陰性對照組；培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)72 h，消化并收集細胞。固定(-20 ℃無水乙醇)制備好的單細胞懸液，加入100 μL RNaseA，37 ℃ 30 min；再加入400 μL碘化丙啶PI染色30 min，采用流式細胞儀檢測。每個樣本獲取10 000個細胞，采用ModFitLT 3.0軟件分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1CCK8檢測細胞增殖 中藥物組和陽性對照組SiHa細胞增殖均有不同程度的抑制，陰性對照組細胞生長活躍，中藥物組和陽性對照組與陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且在24 h對其增殖的影響最為明顯。見表1。

表1 各組宮頸癌SiHa細胞增殖比較值)

注:與陰性對照組比較，*P<0.05

2.2流式細胞儀檢測細胞周期變化 與陰性對照組比較，中藥物組和陽性對照組SiHa細胞中G0/G1期細胞顯著增多，S期細胞顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組SiHa細胞周期比較(%)

注:與陰性對照組比較，*P<0.05

2.3流式細胞儀檢測凋亡變化 中藥物組和陽性對照組SiHa細胞凋亡率顯著高于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 各組SiHa細胞凋亡率比較

注:與陰性對照組比較，*P<0.05

3 討 論

宮頸癌是女性發(fā)生比例較高的惡性腫瘤之一，其在發(fā)展中國家的發(fā)病率較高。宮頸癌發(fā)生過程通常為正常宮頸上皮發(fā)展為上皮內(nèi)瘤變最后進展為宮頸癌，其中高危型HPV持續(xù)感染是促進瘤變發(fā)生的主要因素。

保婦康栓的主要成分為冰片和莪術。莪術為姜科姜黃屬植物蓬莪術、廣西莪術和溫郁金的干燥根莖，性溫味辛苦，具有較好的抗腫瘤、抗炎、抗病原體、抗早孕、抗纖維組織增生和保肝等多種作用。其活性成分為揮發(fā)油，包括β-欖香烯、莪術酮、莪術醇和吉瑪酮等，能直接抑制、破壞腫瘤細胞和滅活病原體，還可增強機體自身免疫功能，從而促進機體對腫瘤和病毒的免疫反應[8-13]。冰片亦可消炎止痛并促進藥物吸收。保婦康栓單獨或聯(lián)合用藥已成為宮頸持續(xù)性高危型HPV感染的主要治療手段之一，將保婦康栓置于患者宮頸內(nèi)部，莪術油可活血化瘀、清熱解毒，提升局部免疫力，增加巨噬細胞吞噬能力，去腐生肌，消滅HPV及多種致病菌，促進鱗狀上皮細胞生長，修復炎癥損傷，促進康復[6-7]。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞增殖和凋亡異常密切相關，因此，臨床治療腫瘤重要的策略之一就是誘導、促進腫瘤細胞凋亡。因此，本研究選擇HPV16陽性人宮頸鱗癌細胞系SiHa細胞作為研究對象，通過CCK8實驗發(fā)現(xiàn)，保婦康栓含藥血清能抑制SiHa細胞增殖；流式細胞分析結(jié)果顯示，保婦康栓含藥血清作用后可引起SiHa細胞中G0/G1期細胞顯著增多，S期細胞顯著減少，周期阻斷于S期，即細胞的DNA合成期，以致細胞不能進入下一個周期，細胞增殖減少，凋亡增加。以往有研究表明，莪術油的主要成分姜黃素和欖香烯對腫瘤細胞周期具有抑制作用[10,14-15]。說明保婦康栓含藥血清能抑制SiHa細胞增殖的作用機制可能是由于藥物誘導了細胞的凋亡程序。

4 結(jié) 論

中藥保婦康栓對宮頸癌的預防和治療作用機制可能是通過調(diào)控腫瘤細胞周期，從而抑制腫瘤細胞增殖并促進細胞凋亡來實現(xiàn)的。然而中藥保婦康栓體外抑制SiHa細胞增殖的效果弱于西藥干擾素，這也是臨床單獨應用保婦康栓可使癥狀緩解但無法徹底治愈的原因之一，因此，臨床常采用聯(lián)合用藥，效果更顯著。