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柴達(dá)木盆地在動(dòng)物地理區(qū)劃上屬西部荒漠亞區(qū)，其蚤類區(qū)系以古北界種類為主，不少種屬為青藏高原特有種，具有較高的科學(xué)價(jià)值[1]。蚤類除因叮咬和吸血等行為對(duì)動(dòng)物造成直接危害外，其傳播重大傳染病的媒介效能(如鼠疫、地方性斑疹傷寒等)也奠定了蚤類的重要醫(yī)學(xué)地位[2]。

醫(yī)學(xué)病媒生物的鑒定與識(shí)別，是控制疾病發(fā)生的核心步驟，也是疾病監(jiān)測(cè)的基礎(chǔ)工作。常規(guī)形態(tài)學(xué)手段要求分類人員必須掌握扎實(shí)的分類知識(shí)，同時(shí)需要保持被鑒定標(biāo)本完整且典型的分類特征。目前分類學(xué)者人數(shù)急劇縮減，使分類鑒定工作面臨巨大挑戰(zhàn)，急切需要一種物種鑒定新方法產(chǎn)生。DNA條形碼技術(shù)的出現(xiàn)解決了形態(tài)鑒定的諸多困境[3-4]。在大多數(shù)動(dòng)物類群中，線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I基因(COI)已被廣泛采納為通用的標(biāo)準(zhǔn)條形碼基因片段[5-7]。鑒于上述原因，我們對(duì)柴達(dá)木盆地寄生蚤種的COI基因序列進(jìn)行研究，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)分類法的不足，積累柴達(dá)木盆地寄生蚤COI基因部分序列的數(shù)據(jù)信息，探索建立醫(yī)學(xué)媒介生物快捷鑒定的新方法，這對(duì)整個(gè)動(dòng)物學(xué)分子鑒定及遺傳學(xué)研究具有重要的學(xué)術(shù)意義。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 本研究使用的68份蚤DNA樣品，采自柴達(dá)木盆地1市2縣的68匹蚤(樣點(diǎn)分布如圖1)。將保存于75%酒精中的蚤樣本用眼科鑷輕輕攝出，置于解剖鏡下，用手術(shù)刀片將其腹部切開，再將單匹蚤體放入1.5 mL離心管中備用。根據(jù)QIAGEN試劑盒DNA提取步驟制備蚤DNA模板，并將模板置于-20 ℃保存。樣本來(lái)源詳見表1。

圖1 青海省部分蚤種樣本采集點(diǎn)信息 Fig.1 Sampling location of fleas used in present study in Qinghai

1.2PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增體系：10×buffer 2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.15 μL，上下游引物各0.5 μL，模板2 μL，最后用dd H2O補(bǔ)齊反應(yīng)體系至25 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，94 ℃變性 1 min，其中前10個(gè)循環(huán)的退火溫度為55 ℃，后30個(gè)循環(huán)的退火溫度為50 ℃，退火時(shí)間均30 s。72 ℃延伸40 s。擴(kuò)增時(shí)選用通用引物擴(kuò)增COI基因片段[8]，引物序列L1490(5′-GTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′)和H2198(5′-AAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT-3′)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選取條帶清晰樣品送北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序(如圖2)。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products

1.3DNA序列分析 首先用Chromos軟件觀察測(cè)序峰圖質(zhì)量，選取峰圖質(zhì)量較高的測(cè)序結(jié)果在NCBI上運(yùn)行BLAST程序進(jìn)行序列同源性比較，以確保所獲序列是目的序列。再用Clustal X軟件[9]進(jìn)行多重序列比對(duì)，將比對(duì)結(jié)果導(dǎo)入Mega 6.0軟件[10]，基于Kimura-2-parameter模型[11]進(jìn)行堿基組成計(jì)算和分析、序列信息位點(diǎn)檢測(cè)、轉(zhuǎn)換數(shù)與顛換數(shù)及其比值等。

2 結(jié) 果

2.1蚤類COI基因部分序列描述 共測(cè)得3總科5科11屬19種蚤計(jì)68條COI序列，另外從GenBank中查詢的蚤類同源序列經(jīng)Mega 6.0軟件進(jìn)行序列組成分析，結(jié)果顯示COI基因序列中保守位點(diǎn)有336個(gè)，變異位點(diǎn)有261個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)有252個(gè)，自裔位點(diǎn)有9個(gè)。同時(shí)A、T、C、G堿基的平均含量分別為27.2%、39.7%、17.7%、15.4%，其中A+T含量(66.9%)遠(yuǎn)高于G+C含量(33.1%)，與目前已測(cè)線粒體DNA序列中較高的A+T含量現(xiàn)象相一致。

由表2可以看出，COI基因序列的堿基轉(zhuǎn)換值明顯高于顛換。T、C間的轉(zhuǎn)換平均數(shù)是204，A、G間的轉(zhuǎn)換平均數(shù)是137，TC轉(zhuǎn)換大于AG間的轉(zhuǎn)換。轉(zhuǎn)換/顛換的平均值0.08，轉(zhuǎn)換主要發(fā)生于A-G之間，顛換主要發(fā)生于T-A之間。第1位點(diǎn)R值最小，僅0.78，說(shuō)明第一位點(diǎn)的替換多是同義替換，不會(huì)導(dǎo)致氨基酸的改變。

2.2NJ法構(gòu)建系統(tǒng)樹 運(yùn)用Mega 6.0軟件，基于Kimura-2-parameter模型，采用NJ鄰接法構(gòu)建柴達(dá)木盆地常見寄生蚤COI基因序列的NJ樹(圖3)，對(duì)NJ樹進(jìn)行內(nèi)部分支檢驗(yàn)與1 000次Bootstrap檢驗(yàn)分析，來(lái)確定各支系的置信度。

表2 柴達(dá)木盆地蚤類COI基因堿基替換數(shù)Tab.2 Base substitutions on COI gene of fleas from Qaidam Basin

圖3 基于Kimura-2-parameter模型構(gòu)建蚤類NJ系統(tǒng)樹Fig.3 A neighbor-joining phylogenetic tree of fleas based on Kimura 2-parameter model

3 討 論

3.1遺傳距離差異 柴達(dá)木盆地19種蚤的COI序列其平均遺傳距離為16.1%，種內(nèi)遺傳距離0.01%～2.9%，種間遺傳距離3%～15.4%，種間遺傳距離顯著大于種內(nèi)遺傳距離。種屬間遺傳距離如圖4所示。

圖4 柴達(dá)木盆地蚤類COI基因部分序列遺傳距離差異分析Fig.4 Analysis of genetic distance on partial COI gene sequence of fleas from Qaidam Basin

3.2形態(tài)結(jié)果的修訂 本研究中我們挑選了形態(tài)特征比較明顯的非透明蚤標(biāo)本做分子實(shí)驗(yàn)，即便這樣，在分析和比對(duì)本研究的蚤類COI基因部分序列時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)一些種類的形態(tài)鑒別可能存在誤定問(wèn)題，尤其是雌蚤的鑒定結(jié)果。例如編號(hào)Z138的雙蚤雌蚤(符合雙蚤屬屬征：僅有胸櫛，腹節(jié)背板有副鬃列，眼鬃位于眼的上方、觸角窩的前緣，眼的前方有可見的幕骨拱，后足第5跗節(jié)4對(duì)側(cè)蹠鬃、1對(duì)蹠鬃)，且第7腹板后緣較平，初鑒為原雙蚤指名亞種；編號(hào)Z147、Z148的雌蚤在鏡檢時(shí)也符合雙蚤屬的屬征，但第7腹板后緣具淺凹，下段不外斜，初步鑒定為方指雙蚤。這3匹雌蚤均采自格爾木白尾松田鼠體表，因該地區(qū)未采到相應(yīng)雄蚤，先暫以形態(tài)鑒定命名。在后續(xù)工作中發(fā)現(xiàn)這3匹蚤和GeneBank登錄號(hào)為MG138278、MG138279的直緣雙蚤指名亞種的雄蚤聚為一支，且置信度為99%。根據(jù)蚤類形態(tài)鑒別以雄性為主，雌性為輔的特性，所以我們?cè)诜肿咏Y(jié)果分析時(shí)結(jié)合現(xiàn)場(chǎng)鑒定結(jié)果、宿主和地區(qū)分布等綜合考量，將這3匹雌蚤復(fù)鑒為直緣雙蚤指名亞種。

實(shí)際工作應(yīng)用中，一些雌蚤種一級(jí)的分類特征差異很小，我們?cè)谛螒B(tài)分類時(shí)只能鑒定到屬，無(wú)法鑒定到種。若想細(xì)分，最好在同地區(qū)再次補(bǔ)點(diǎn)進(jìn)行樣本采集，以期獲得該屬雄蚤，看能否和雌蚤進(jìn)行配對(duì)鑒定。如果雄蚤特征不匹配或現(xiàn)場(chǎng)補(bǔ)樣條件不允許，可通過(guò)分子試驗(yàn)的COI基因數(shù)據(jù)在GeneBank基因庫(kù)中比對(duì)后，再綜合分子聚類結(jié)果和現(xiàn)場(chǎng)樣本采集信息進(jìn)行準(zhǔn)確分類鑒定。

鑒于形態(tài)常規(guī)分類存在鑒定錯(cuò)判的可能，今后蚤類鑒定應(yīng)以外部形態(tài)鑒定為主，結(jié)合分子鑒定結(jié)果，可更好地發(fā)現(xiàn)和糾正傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定中的錯(cuò)誤，從而準(zhǔn)確鑒別物種。

3.3系統(tǒng)樹的構(gòu)建和存在的問(wèn)題 構(gòu)建的系統(tǒng)樹顯示所有個(gè)體形成19個(gè)高支持度的單一分支，提示蚤種類應(yīng)該有19種，這和蚤憑證標(biāo)本復(fù)核結(jié)果大致一致，說(shuō)明DNA條形碼技術(shù)可用于蚤類的鑒定。

形態(tài)鑒別結(jié)果為禿病蚤田鼠亞種和禿病蚤指名亞種的COI基因序列在NJ樹中卻聚為一個(gè)分支，置信度100%，考慮亞種在形態(tài)鑒別中的很多問(wèn)題和歧義等實(shí)際問(wèn)題，筆者認(rèn)為把這一分支直接定為種的階元-禿病蚤，而不再往下細(xì)分更為合理些。

NJ樹中長(zhǎng)鬃雙蚤和共和雙蚤分支蚤種鑒定出現(xiàn)問(wèn)題最多，暫時(shí)把這兩個(gè)雙蚤分支歸為疑似長(zhǎng)鬃雙蚤、疑似共和雙蚤類群。我們?cè)偃龔?fù)核這兩個(gè)分支的憑證標(biāo)本，最后分析出現(xiàn)的問(wèn)題原因大致有二，一是雙蚤屬雌蚤形態(tài)鑒定只能憑第7復(fù)板后緣凹陷的深淺及廣度，差別細(xì)微，主觀性較強(qiáng)，極易造成誤鑒或只能粗略鑒定到屬。二是雄蚤形態(tài)復(fù)鑒無(wú)誤，但分子結(jié)果卻和形態(tài)結(jié)果不相一致的問(wèn)題。例如，1匹雄蚤形態(tài)鑒定為長(zhǎng)鬃雙蚤，復(fù)檢透明標(biāo)本后我們認(rèn)為形態(tài)鑒別無(wú)誤，但它卻和共和雙蚤聚為一支。關(guān)于這些形態(tài)極其相似、地理分布相近的蚤種分類，建議今后在形態(tài)分類基礎(chǔ)上開展多基因分子標(biāo)記，尤其是線粒體基因和核基因聯(lián)合標(biāo)記研究，以便精準(zhǔn)分析種群遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育。

綜上所述，盡管DNA條形碼鑒定技術(shù)前景非常樂(lè)觀，但目前分子鑒定技術(shù)的正確做法還是應(yīng)以傳統(tǒng)分類法為基礎(chǔ)，保證分類物種為純種且鑒別正確，在此基礎(chǔ)上測(cè)定的COI基因序列才能作為該物種的DNA條形編碼。并盡可能留存憑證標(biāo)本，以供其他學(xué)者對(duì)形態(tài)數(shù)據(jù)和基因數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)研究時(shí)做一參比。