張輝 王運(yùn)良

1 腦卒中的病理生理

缺血性腦卒中主要由大腦動(dòng)脈血栓栓塞引起，當(dāng)栓子或血栓原位阻塞腦動(dòng)脈時(shí)，循環(huán)的血小板迅速聚集到阻塞的血管部位，與組織因子激活凝血過(guò)程產(chǎn)生凝血酶和纖維蛋白，是形成動(dòng)脈血栓的主要原因[1]。同時(shí)，腦動(dòng)脈閉塞引發(fā)下游微血管繼發(fā)性血栓形成，導(dǎo)致腦內(nèi)皮細(xì)胞、外周細(xì)胞和星形細(xì)胞功能障礙并導(dǎo)致血腦屏障（BBB）破壞和細(xì)胞缺血性損傷[2]。因此，缺血性腦卒中的首要目標(biāo)是閉塞血管的迅速再通，在缺血性腦微血管床重建CBF，保持血管完整性，減少神經(jīng)元死亡。腦卒中恢復(fù)過(guò)程中，缺血腦組織經(jīng)歷一系列重塑事件，激活血管相對(duì)靜止的內(nèi)皮細(xì)胞，引起腦血管生成。除內(nèi)皮細(xì)胞外，循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞也參與新血管生成。血管生成不僅發(fā)生在梗死周?chē)舶l(fā)生在側(cè)腦室/腦室下區(qū)（V/SVZ）。在恢復(fù)早期，生成的血管具有滲透性，當(dāng)新血管成熟時(shí)，滲透功能下降，因此，血管生成與改善神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)后密切相關(guān)[3]。

神經(jīng)干細(xì)胞存在于成年嚙齒類腦V/SVZ和齒狀回亞顆粒區(qū)，在整個(gè)生命周期產(chǎn)生新的神經(jīng)元。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腦卒中增加神經(jīng)發(fā)生，在缺血腦組織也觀察到神經(jīng)祖細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞增加。腦卒中引起的神經(jīng)發(fā)生與血管生成相結(jié)合，誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞增殖與腦內(nèi)皮細(xì)胞活化有關(guān)[4]。V/SVZ新生成的神經(jīng)母細(xì)胞沿腦血管遷移至梗死周?chē)鷧^(qū)域，在腦修復(fù)過(guò)程中起功能性作用，除祖細(xì)胞外，神經(jīng)干細(xì)胞還產(chǎn)生少突膠質(zhì)祖細(xì)胞（OPCs），并分化成髓鞘化的少突膠質(zhì)細(xì)胞。在腦修復(fù)過(guò)程中，OPCs產(chǎn)生的少突膠質(zhì)細(xì)胞在梗死周?chē)屹|(zhì)和白質(zhì)再生軸突形成髓鞘[5]。

2 外泌體功能

2.1 外泌體與miRNAs

實(shí)驗(yàn)研究提示細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間分子通過(guò)自分泌和旁分泌作用介導(dǎo)腦重塑過(guò)程，在小鼠局灶性缺血模型，血管miRNA-15a（miR-15a）下調(diào)通過(guò)增加成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（FGF2）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）水平，促進(jìn)梗死周?chē)鷧^(qū)誘導(dǎo)的血管生成，血管生成內(nèi)皮細(xì)胞釋放VEGF也與神經(jīng)祖細(xì)胞受體VEGFR2相互作用，促進(jìn)其增殖和神經(jīng)元分化。而且，腦白質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）和FGF2參與損傷后腦內(nèi)髓鞘化少突膠質(zhì)細(xì)胞的再生[6]。體外研究發(fā)現(xiàn)，腦腦卒中誘導(dǎo)miR-9和miR-200b表達(dá)下調(diào)介導(dǎo)白質(zhì)髓鞘再形成，而反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的硫酸軟骨素蛋白聚糖（CSPGs）抑制軸突再生。miR-17-92簇或miR-27a在皮層神經(jīng)元過(guò)表達(dá)，通過(guò)抑制磷酸酶、磷酸酯酶、張力蛋白同源物（PTEN）和Ras同源物家族成員A（RhoA）信號(hào)，激活神經(jīng)元內(nèi)生長(zhǎng)信號(hào)，從而克服CSPG的抑制作用。成年脊髓損傷動(dòng)物研究表明抑制神經(jīng)元PTEN信號(hào)也能促進(jìn)軸突芽生[7]。

外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間聯(lián)系將物質(zhì)從源細(xì)胞轉(zhuǎn)移到目標(biāo)細(xì)胞，有助于大腦重塑。從CSF分離的外泌體富含四肽蛋白（CD63，CD81），轉(zhuǎn)運(yùn)體內(nèi)Alix調(diào)控因子和伴侶蛋白HSP70。四跨膜蛋白、Alix和HSP70已作為外泌體的標(biāo)記物，蛋白組學(xué)和RNA分析表明外泌體攜帶脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和RNA，包括mRNA和miRNA，但不清楚這些物質(zhì)是如何裝入單個(gè)外泌體的[8-9]。體內(nèi)研究表明，轉(zhuǎn)基因小鼠外泌體過(guò)表達(dá)人類β-淀粉樣蛋白（Aβ）前體蛋白（APP），含有高水平的完整APP和APP的C末端片段。與阿爾茨海默病（AD）患者腦組織外泌體內(nèi)檢測(cè)到的APP和C末端片段一致，認(rèn)為Aβ肽的釋放與外泌體有關(guān)，富含神經(jīng)毒素APP的C末端片段可能導(dǎo)致Aβ肽向大腦播散[10]。

2.2 外泌體與腦血管生成

循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)mRNAs和PI3K/Akt信號(hào)以及miRNAs，進(jìn)入受體內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致血管生成。培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的外泌體通過(guò)釋放促血管生成蛋白、mRNAs和miRNAs進(jìn)入腦內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)血管生成。在LPS和細(xì)胞因子的刺激下，小鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞分泌外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)miRNAs，增加受體血管外周細(xì)胞VEGF-B mRNA和蛋白水平，VEGF-B及其受體VEGFR-1介導(dǎo)血管生成。此外，腦內(nèi)皮細(xì)胞和外周細(xì)胞之間Notch信號(hào)通路激活是腦血管生成和血腦屏障完整性的必要條件，Notch信號(hào)通路與VEGF相互作用介導(dǎo)血管生成，維持血腦屏障的完整性[11]。蛋白組學(xué)和miRNA陣列分析顯示，腦卒中可改變外泌體載脂蛋白和miRNA，提示腦腦卒中可改變腦內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞外泌體含量。缺血性神經(jīng)祖細(xì)胞來(lái)源的外泌體促進(jìn)原發(fā)性內(nèi)皮細(xì)胞遷移和毛細(xì)管形成，而腦內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞增殖和神經(jīng)元分化[12]。

2.3 外泌體與神經(jīng)發(fā)生

成年嚙齒動(dòng)物腦V/SVZ區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞與鄰近血管、細(xì)胞和腦脊液接觸，不斷交換分子信號(hào)。腦脊液外泌體和神經(jīng)干細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞間通路，分別介導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞和免疫功能。從胚胎腦脊液分離的外泌體含有IGF信號(hào)通路蛋白和miRNA成分，胚胎干細(xì)胞與CSF外泌體孵育激活神經(jīng)干細(xì)胞的IGF/mTORC1通路，促進(jìn)干細(xì)胞增殖[13]。成年小鼠V/SVZ神經(jīng)干細(xì)胞的促炎因子導(dǎo)致mRNAs編碼IFN-γ信號(hào)通路的外泌體釋放，外泌體通過(guò)相關(guān)IFN-γ及其受體IFNGR1激活受體細(xì)胞STAT1信號(hào)。腦腦卒中可激活先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，因此，神經(jīng)干細(xì)胞釋放的外泌體也在腦卒中與免疫系統(tǒng)發(fā)生聯(lián)系[14]。

2.4 外泌體與神經(jīng)可塑性

皮層神經(jīng)元釋放外泌體攜帶谷氨酸受體神經(jīng)元特異性蛋白L1細(xì)胞粘附分子（L1CAM）和GluR2/3亞基，神經(jīng)元胞質(zhì)鈣的增加和神經(jīng)元去極化增加外泌體的分泌。神經(jīng)元釋放的外泌體含有α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（AMPA）受體，去極化神經(jīng)元神經(jīng)突分泌的外泌體富含微管相關(guān)蛋白1b（MAP1b）和靶向神經(jīng)突可塑性相關(guān)基因miRNA，導(dǎo)致神經(jīng)突生長(zhǎng)增強(qiáng)[15]。RARβ受體激動(dòng)劑滅活皮質(zhì)神經(jīng)元PTEN信號(hào)，增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。皮層神經(jīng)元釋放外泌體將miR-124轉(zhuǎn)移至星形細(xì)胞，增加星形細(xì)胞興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT-1表達(dá)。AMPA受體和MAP1b是突觸和樹(shù)突可塑性及軸突芽生的關(guān)鍵因子，AMPA受體激活有助于腦卒中后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，抑制神經(jīng)元PTEN信號(hào)和減少星形細(xì)胞瘢痕，促進(jìn)脊髓損傷和腦卒中后CNS軸突芽生[16]。因此，神經(jīng)元外泌體通過(guò)神經(jīng)元之間的突觸轉(zhuǎn)運(yùn)及與星形細(xì)胞的聯(lián)系，介導(dǎo)突觸和軸突的可塑性，參與缺血后軸突和突觸重塑。

2.5 外泌體與認(rèn)知缺失

腦卒中加速認(rèn)知減退和AD發(fā)生，特點(diǎn)是腦內(nèi)Aβ分泌到細(xì)胞外環(huán)境，產(chǎn)生和清除之間的不平衡導(dǎo)致Aβ積累。培養(yǎng)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分泌的外泌體含有Aβ，經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)化的神經(jīng)元外泌體增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞接受和降解Aβ的能力[17]。此外，他汀類藥物刺激小膠質(zhì)細(xì)胞分泌富含胰島素降解酶（IDE）的外泌體，促進(jìn)細(xì)胞外Aβ肽的清除。辛伐他汀治療腦腦卒中及創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）增強(qiáng)腦缺血修復(fù)過(guò)程，包括軸突芽生，改善自身物體識(shí)別和時(shí)間順序記憶[18]。但他汀類藥物是否改變小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體降解Aβ的能力還有待證實(shí)。

3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）源性外泌體

MSCs可改善腦卒中和腦外傷后的神經(jīng)功能預(yù)后，研究表明MSCs促進(jìn)腦損傷后血管生成、神經(jīng)發(fā)生和白質(zhì)重塑，通過(guò)分泌因子參與腦修復(fù)的信號(hào)通路。MSCs對(duì)腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞的旁分泌作用，而非細(xì)胞替代，是MSC治療益處的基礎(chǔ)。與其他細(xì)胞相比，MSCs分泌大量的外泌體，調(diào)節(jié)腦微環(huán)境，對(duì)腦卒中和腦外傷有治療作用[19]。局灶性腦缺血大鼠靜脈注射MSC來(lái)源的外泌體，通過(guò)促進(jìn)腦卒中恢復(fù)過(guò)程的神經(jīng)血管重構(gòu)，改善神經(jīng)功能。全身應(yīng)用MSC減少運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能缺失，增加血管生成和神經(jīng)發(fā)生，而應(yīng)用人MSC治療TBI小鼠，在很大程度上保留空間學(xué)習(xí)能力。提示MSC來(lái)源的外泌體介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間聯(lián)系有助于MSC治療的療效。

外泌體將載體miRNA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，miRNA與argonaute2（AGO2）結(jié)合，稱為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶miRNA的工程MSC外泌體使腦卒中誘導(dǎo)的腦缺血miR-133b下調(diào)。皮質(zhì)神經(jīng)元外泌體可下調(diào)RhoA并促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)，而應(yīng)用miR-133b升高的外泌體處理星形膠質(zhì)細(xì)胞則抑制CTGF?？傊琈SC源性外泌體可調(diào)控受體神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞基因的miRNA載體，腦卒中誘導(dǎo)外周血免疫抑制，加重腦卒中結(jié)果，給予MSC來(lái)源的外泌體可與外周血中的自然殺傷細(xì)胞和淋巴細(xì)胞發(fā)生聯(lián)系，以減輕缺血后免疫抑制[20]。

4 造血干細(xì)胞（HSC）外泌體

心肌缺血研究表明，CD34+造血干細(xì)胞（HSCs）源性重組蛋白（Shh）外泌體能轉(zhuǎn)移Shh功能和激活受體細(xì)胞Shh信號(hào)通路，增強(qiáng)梗死邊緣血管生成和維持心臟功能。Shh對(duì)神經(jīng)發(fā)生的調(diào)控發(fā)揮重要作用，可傳遞功能蛋白來(lái)調(diào)節(jié)受體細(xì)胞功能，促進(jìn)腦卒中后的腦重構(gòu)[21]。

外泌體能通過(guò)血腦屏障，經(jīng)鼻給予標(biāo)記的外泌體，熒光顆?？煞植颊麄€(gè)大腦，以嗅球?yàn)橹?。小鼠海馬注射含有外泌體的Cre-重組酶mRNA，激活海馬神經(jīng)元lacZ報(bào)告基因，表明外泌體Cre重組酶mRNA激活受體神經(jīng)元的報(bào)告基因[22]。此外，靜脈注射表達(dá)融合蛋白的外泌體，顯示其靶向細(xì)胞為腦內(nèi)神經(jīng)元、小膠質(zhì)和少突膠質(zhì)細(xì)胞。說(shuō)明外泌體不僅能穿過(guò)血腦屏障，而且能傳遞功能物質(zhì)，在大腦特定受體細(xì)胞觸發(fā)基因表達(dá)。

5 結(jié)論

外泌體在腦腦卒中和神經(jīng)損傷后修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要的細(xì)胞間作用，無(wú)論是自體產(chǎn)生還是從干細(xì)胞/祖細(xì)胞提取的工程外泌體，都具有治療價(jià)值。但仍有許多問(wèn)題需要闡明：一是如何識(shí)別缺血后腦實(shí)質(zhì)和遠(yuǎn)端器官釋放外泌體的含量和細(xì)胞信號(hào)；其次是外泌體如何影響腦受體細(xì)胞內(nèi)源性基因和蛋白質(zhì)表達(dá)；三是確定腦細(xì)胞源性外泌體的靶向細(xì)胞類型?？傊饷隗w作為缺血性腦細(xì)胞間的一種聯(lián)系，為腦卒中發(fā)病機(jī)制提供新的見(jiàn)解，有助于外泌體治療的發(fā)展，促進(jìn)腦卒中的康復(fù)。