譚 楨 張 丹 程建文 李曉峰

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，南寧市 530007；2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，南寧市 530021；3 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手外科，南寧市 530021)

骨重建包括骨形成和骨吸收兩種相互平衡的過(guò)程，分別由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞調(diào)控[1]。破骨細(xì)胞的過(guò)度作用導(dǎo)致骨吸收增多，打破骨形成和骨吸收的平衡，將引起如骨質(zhì)疏松癥等疾病，破骨細(xì)胞在這類(lèi)疾病中的作用非常關(guān)鍵[2]。

骨保護(hù)素/核因子-κB受體活化因子配體/核因子-κB受體活化因子(OPG/RANKL/RANK)通路與破骨細(xì)胞的形成和分化密切相關(guān)[3]，通過(guò)RANKL/RANK信號(hào)的刺激，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化[4]。有研究表明，柚皮苷具有抑制破骨細(xì)胞分化及抗骨質(zhì)疏松的作用[5]。新橙皮苷是一種枳實(shí)提取物，與柚皮苷均為黃酮類(lèi)化合物[6]，具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗腫瘤及抗炎等作用[7]。但有關(guān)新橙皮苷對(duì)破骨細(xì)胞作用的研究仍較少。我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同濃度的新橙皮苷對(duì)破骨細(xì)胞的凋亡率及活力無(wú)影響，但是能抑制破骨細(xì)胞的分化，且具有時(shí)間依賴(lài)性?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 α-MEM液和胎牛血清購(gòu)自澳大利亞TRACE公司，GST-rRANKL購(gòu)自澳大利亞西澳大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新橙皮苷(純度>98%)購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 破骨細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將RAW264.7細(xì)胞種植至含有胞分化培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜。第二天更換培養(yǎng)基，將不同濃度的新橙皮苷加入培養(yǎng)孔中，濃度分別為0 μM、1 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM和20 μM，孵育細(xì)胞24 h。用PBS洗滌兩次后收集細(xì)胞，用0.5 mL Annexin V Binding緩沖液重懸細(xì)胞以及Annexin V-PE液染色細(xì)胞懸浮液。在室溫暗室繼續(xù)孵育細(xì)胞15 min，最后加入Binding緩沖液，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析并獲得健康細(xì)胞率、細(xì)胞死亡率以及細(xì)胞凋亡率。

1.3 破骨細(xì)胞活力的測(cè)定 將小鼠骨髓巨噬細(xì)胞以6×103個(gè)/孔的密度種植入含有細(xì)胞分化培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板，分5組，每組3個(gè)孔。加入RANKL培養(yǎng)過(guò)夜,加入不同濃度的新橙皮苷(0 μM、2.5 μM、5 μM、10 μM、20 μM)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。吸取20 μL CellTiter 96?試劑，分別加入96孔培養(yǎng)板的每個(gè)細(xì)胞樣本孔中。在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用ELISA檢測(cè)儀測(cè)量樣本在490 nm的光吸收值，以新橙皮苷濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制直方圖。

1.4 破骨細(xì)胞生成抑制時(shí)間依賴(lài)性實(shí)驗(yàn) 將小鼠骨髓巨噬細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為D0組(NE-)，實(shí)驗(yàn)組第0天為D0組(NE+)，第1天為D1組(NE+)，第3天為D3組(NE+)，第5天為D5組(NE+)，第7天為D7組(NE+)，每組3個(gè)孔。將骨髓巨噬細(xì)胞以6×103個(gè)/孔種植入96孔培養(yǎng)板，分別于第0、1、3、5、7天給D0組(NE+)、D1組(NE+)、D3組(NE+)、D5組(NE+)、D7組(NE+)加入新橙皮苷10 μM。對(duì)照組D0組(NE-)從第0天開(kāi)始只加入RANKL培養(yǎng)，不加入新橙皮苷。第8天，將各組作TRAP染色。在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)破骨細(xì)胞，將細(xì)胞核≥3個(gè)的細(xì)胞歸類(lèi)為破骨細(xì)胞，并對(duì)TRAP染色陽(yáng)性的破骨細(xì)胞拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SSPS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)組與各自的對(duì)照組進(jìn)行兩兩比較，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x±s)表示，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 破骨細(xì)胞凋亡情況 散點(diǎn)圖結(jié)果顯示各組健康細(xì)胞率分別為94.9%、91.4%、92%、93.9%、91.8%、93.2%，壞死率分別為4.5%、8.1%、7.4%、5.7%、7.8%、6.4%，凋亡率分別為0.6%、0.5%、0.5%、0.5%、0.4%、0.4%。隨著新橙皮苷濃度的增加，各組健康細(xì)胞率均保持于90%以上的高水平，而壞死率和凋亡率均維持在低水平(圖1A、B)。

A.破骨細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖

B.各類(lèi)細(xì)胞狀況

圖1 破骨細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。A.用RANKL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞，同時(shí)加入各濃度新橙皮苷，培養(yǎng)24 h后用Annexin V-PE 液染色細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。B.經(jīng)過(guò)不同濃度新橙皮苷處理的RAW264.7細(xì)胞，凋亡率均低于1%，而健康細(xì)胞率均高于90%。

2.2 新橙皮苷對(duì)破骨細(xì)胞活力的影響 各組吸收值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以0 μM組為對(duì)照，各濃度組藥物對(duì)細(xì)胞活力均無(wú)影響(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 新橙皮苷對(duì)破骨細(xì)胞活力的影響

2.3 破骨細(xì)胞生成抑制時(shí)間依賴(lài)性實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示D0組(NE-)形成的破骨細(xì)胞數(shù)平均為87.3個(gè)，D0組(NE+)為82.7個(gè)，D1組(NE+)為74個(gè)，D3組(NE+)61.3個(gè)，D5組(NE+)61.7個(gè)，D7組(NE+)64.3個(gè)。第1、3、5、7天加入10 μM的新橙皮苷均對(duì)破骨細(xì)胞形成有抑制作用(P<0.01)，其中第5天加入的新橙皮苷對(duì)破骨細(xì)胞形成抑制作用最為顯著(P<0.001)(圖3)。

圖3 破骨細(xì)胞生成抑制時(shí)間依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)

3 討 論

骨質(zhì)疏松是一種“沉默的疾病”，往往到發(fā)生骨折時(shí)才被發(fā)現(xiàn)[8]。中草藥治療骨骼疾病的歷史悠久，它能促進(jìn)骨折愈合，而且安全性比化學(xué)藥品更高[9-11]，是目前治療骨質(zhì)疏松的研究熱點(diǎn)之一。

枳實(shí)是常見(jiàn)的中藥，可提取出各種黃酮類(lèi)化合物[6]，如柚皮蕓香苷(narirutin)、柚皮苷(naringin)、橘皮苷(hesperidin)、析圣草枸櫞苷(neoeriocitrin)和新橙皮苷(neohesperidin)。黃酮類(lèi)化合物具有天然的抗氧化特性，能保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗腫瘤及抗炎等[12-16]。柚皮苷已被證實(shí)在骨質(zhì)疏松治療方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[5，17]。

本實(shí)驗(yàn)旨在研究新橙皮苷對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響，探討其潛在的骨質(zhì)疏松治療作用。目前常用的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞是骨髓巨噬細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞[18-20]。BMM容易貼壁[21]，不易制成細(xì)胞懸液，而RAW264.7細(xì)胞克隆表達(dá)RANK mRNA，能穩(wěn)定地保留RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的遺傳特性和表型，基因表達(dá)與骨髓巨噬相似，且能制成細(xì)胞懸液，非常適合用來(lái)研究破骨細(xì)胞的分化[22]。因此在使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率實(shí)驗(yàn)中，我們采用RAW264.7細(xì)胞。結(jié)果表明，加入不同濃度新橙皮苷后，健康細(xì)胞率均在90%以上，而凋亡率始終維持在低水平。

為了進(jìn)一步檢測(cè)新橙皮苷的安全性，我們進(jìn)行了細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)。目前常用的細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)有MTT和MTS法[23]，而MTS形成的甲瓚產(chǎn)物可溶于水，毒性更少[24]，而且較μTT步驟簡(jiǎn)單。因此，我們采用MTS法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示不同濃度的新橙皮苷對(duì)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞分化的破骨細(xì)胞活力無(wú)明顯影響。

目前對(duì)破骨細(xì)胞分化的信號(hào)通路已有共識(shí)，其中RANKL/RANK信號(hào)通路是影響破骨細(xì)胞分化的主要通路。RANK屬于TNF家族受體，RANKL激活RANK后，使下游一系列蛋白產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括IκB、NF-κB、ERK和cJun/AP-1，促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖和分化[25-26]。RANKL/RANK信號(hào)通路在調(diào)控生理性骨吸收的同時(shí)，也能調(diào)控病理性骨吸收[27]。

在骨破壞性疾病如骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制中破骨細(xì)胞過(guò)度的骨吸收起關(guān)鍵作用。因此，抑制破骨細(xì)胞的形成或活性可以作為治療骨質(zhì)疏松癥的一個(gè)途徑?？梢酝ㄟ^(guò)抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化為T(mén)RAP陽(yáng)性多核巨細(xì)胞，抑制細(xì)胞骨架、細(xì)胞功能形成和影響成熟破骨細(xì)胞生存等多方面進(jìn)行干預(yù)[28]。

在破骨細(xì)胞生成抑制時(shí)間依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)中，于各時(shí)間點(diǎn)在小鼠骨髓巨噬細(xì)胞中加入RANKL及10 μM新橙皮苷進(jìn)行分化誘導(dǎo)。結(jié)果顯示新橙皮苷對(duì)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成具有時(shí)間依賴(lài)性抑制作用，提示新橙皮苷影響RANKL/RANK信號(hào)通路，抑制下游一系列蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制破骨細(xì)胞分化。

綜上所述，新橙皮苷能很好地抑制破骨細(xì)胞的分化，同時(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞活力無(wú)明顯影響，為進(jìn)一步探討影響破骨細(xì)胞分化機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究以及尋找安全有效的抗骨質(zhì)疏松藥物的研究奠定基礎(chǔ)。