李燕新 呂占云 李維 郝延磊

鐵死亡(ferroptosis)是一種鐵離子依賴的、以脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和致死活性氧的積累為特點(diǎn)的非典型的細(xì)胞死亡方式[1]。長(zhǎng)鏈酯酰輔酶A合成酶4（long-chain fattyacyl-CoA synthetase4,ACSL4）、谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase4,GPX4）和胱氨酸-谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)（the cystine/glutamate antiporter system Xc,XCˉ系統(tǒng))是其最重要的調(diào)控分子[2]。另外，磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白1（phosphatidylethanolamine-binding protein1,PEBP1）也在鐵死亡過程中發(fā)揮著重要的作用[3-4]。盡管全世界對(duì)阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease,AD）的研究投入了大量的人力和財(cái)力，但AD的發(fā)病機(jī)制仍然不明確。有研究顯示AD患者腦組織中存在鐵的沉積和鐵代謝的異常，提示鐵的代謝異常可能在AD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[5]。目前鐵死亡的機(jī)制研究多集中于氧化損傷及鐵代謝兩方面，且谷氨酸系統(tǒng)受損、鐵代謝障礙和脂質(zhì)過氧化水平升高參與AD的發(fā)病，然而鐵死亡與AD相關(guān)性的研究相對(duì)比較少，鐵死亡相關(guān)蛋白在AD發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。基于先前報(bào)道的PSEN1p.G378E突變的AD家系[6-8]，本研究構(gòu)建了PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠，采用免疫印跡的方法檢測(cè)其海馬組織中鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，以探討鐵死亡在AD中的作用。

1 動(dòng)物與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組我們委托賽業(yè)生物科技公司進(jìn)行了PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠模型的構(gòu)建，于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖，根據(jù)基因測(cè)序結(jié)果將其分為WT組、PSEN1p.G378E-/+組和PSEN1p.G378E-/-組，隨機(jī)選取5月齡的三組小鼠各10只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 小鼠基因型的鑒定小鼠出生2周后，剪取2～5mm的小鼠尾尖組織，按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）的步驟提取DNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR引物采用Primer5軟件設(shè)計(jì)，并通過 Primer-BLAST（http//www.ncbi.nlm.nib.gov/tools/primerblast）對(duì)照NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行引物特異性匹配，選擇合適的引物序列，由上海生工生物工程有限公司合成，F(xiàn)：5’-CTGTACACACCACTTACTGACTTCTC-3’R：5’-CCCAAAAG GTTGTTCTCTGAGAG-3’， 采用30μL 的反應(yīng)體系： 包括 Taq Hot Start酶0.15μL、Buffer3μL、dNTP3μL、上下游引物（10μM）各1μL、DNA2μL及雙蒸水19.85μL。 PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸5min，4℃停止。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)出目的條帶后，送上海生物工程公司測(cè)序。

1.3 Western blot檢測(cè)鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠 （0.1mL/10g）后，取小鼠新鮮海馬組織，運(yùn)用液氮研磨的方法提取蛋白，測(cè)定蛋白濃度（BCA法），以RIPA裂解液調(diào)整蛋白樣本終濃度為3mg/mL。配制5%濃縮膠，10%分離膠，每孔蛋白上樣量為30μg。電泳約1.5h，轉(zhuǎn)膜90min，用5%的脫脂奶粉室溫封閉1h后， 用兔抗 GPX4多克隆抗體（Abclonal，1：2000）、兔抗 SLC7A11多克隆抗體 （Abclonal，1：2000）、兔抗 ACSL4多克隆抗體 （Abclonal，1：2000）、 兔抗PEBP1多 克 隆 抗 體 （Abclonal，1：2000）、 鼠 抗GAPDH 單克隆抗體 （Abcam，1：50000）4℃孵育過夜，二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（碧云天，1：1000）室溫孵育1h，用化學(xué)發(fā)光試劑盒（Millipore）進(jìn)行顯色曝光，分析各電泳帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊則采用單因素方差分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異后再進(jìn)行兩兩比較（LSD檢驗(yàn)），方差不齊則采用Krudkal-Wallis H檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型的鑒定根據(jù)測(cè)序峰圖，將小鼠分為三種類型：野生型（wild type,WT）、雜合型（PSEN1p.G378E-/+）、純合型（PSEN1p.G378E-/-），詳見圖1。

2.2 鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

2.2.1GPX4蛋白的表達(dá)情況 WT組、PSEN1p.G378E-/+組和 PSEN1p.G378E-/-組的GPX4蛋白表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=65.167，P＜0.001），PSEN1p.G378E-/+組的GPX4蛋白表達(dá)量是WT組的1.54倍 （P=0.01），PSEN1p.G378E-/-組的 GPX4的蛋白表達(dá)量是 WT組的1.97倍 （P＜0.001），PSEN1p.G378E-/-組比 PSEN1p.G378E-/+組增加了27.5%（P=0.002）（表1，圖2）。

2.2.2SLC7A11蛋白的表達(dá)情況 WT組、PSEN1p.G378E-/+組和 PSEN1p.G378E-/-組的SLC7A11蛋白表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=22.390，P=0.002），PSEN1p.G378E-/+組與WT組的SLC7A11蛋白表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.232），PSEN1p.G378E-/-組的SLC7A11的蛋白表達(dá)量是WT組的1.32倍（P=0.001），PSEN1p.G378E-/-組比 PSEN1p.G378E-/+組增加了23.6%（P=0.002）（表1，圖2）。

2.2.3ACSL4蛋白的表達(dá)情況 WT組、PSEN1p.G378E-/+組和 PSEN1p.G378E-/-組的 ACSL4蛋白表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=256.262，P<0.001），PSEN1p.G378E-/+組與WT組的ACSL4蛋白表達(dá)量無明顯差異 （P=0.115），PSEN1p.G378E-/-組的ACSL4的蛋白表達(dá)量是 WT組的2.69倍 （P<0.001），PSEN1p.G378E-/-組 是 PSEN1p.G378E-/+組2.33倍（P<0.001）（表1，圖2）。

2.2.4PEBP1蛋白的表達(dá)情況 WT組、PSEN1p.G378E-/+組和 PSEN1p.G378E-/-組的 ACSL4蛋白表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=151.691，P<0.001），PSEN1p.G378E-/+組比WT組的PEBP1蛋白表達(dá)量增 加27.6%（P=0.001），PSEN1p.G378E-/-組 的PEBP1的蛋白表達(dá)量是 WT組的1.85倍 （P<0.001），PSEN1p.G378E-/-組 是 PSEN1p.G378E-/+組1.45倍（P<0.001）（表1，圖2）。

3 討論

2012年DIXON等[9]首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了鐵死亡這一新型細(xì)胞死亡方式，它在形態(tài)學(xué)、生化、遺傳學(xué)方面不同于其他形式的細(xì)胞死亡。脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的重要步驟，ACSL4參與磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇等帶負(fù)電膜磷脂的合成，促進(jìn)鐵死亡[10-11]，YUAN等[12]發(fā)現(xiàn) ACSL4通過增加具有脂毒性的5羥二十碳四烯酸的表達(dá)來促進(jìn)鐵死亡，可以作為鐵死亡的標(biāo)志物，ACSL4可通過脂質(zhì)改變來抑制神經(jīng)突觸的生長(zhǎng)[13]。PEBP1又稱Raf激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitor protein,RKIP），通過與脂氧合酶結(jié)合，作用于磷脂酰乙醇胺，生成雙/三氧化磷脂酰乙醇胺，導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生[3-4]。PEBP1在早發(fā)型AD（early onset Alzheimer disease，EOAD）患者中的腦脊液中的表達(dá)增加[14]。與先前研究結(jié)果一致，我們發(fā)現(xiàn)ACSL4、PEBP1蛋白的表達(dá)純合組均高于雜合組和野生組，結(jié)果提示可能與AD的疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)磷酸化的Tau蛋白表達(dá)情況純合組均高于雜合和野生組（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）。

圖1 小鼠的基因測(cè)序圖（野生型：WT；雜合型PSEN1p.G378E-/+；純合型PSEN1p.G378E-/-）

圖2 鐵死亡相關(guān)蛋白在三組小鼠海馬中的表達(dá)情況

表1 海馬中GPX4、SLC7A11、ACSL4及PEBP1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平（n=10）

既往研究發(fā)現(xiàn)，GPX4敲除小鼠的腦組織中GPX4的表達(dá)降低，海馬中可見神經(jīng)元丟失、星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，病理特征同AD類似[15]。SLC7A11的主要作用為促進(jìn)胱氨酸的吸收，排出谷氨酸，從而促進(jìn)谷胱甘肽的合成，而谷胱甘肽是GPX4必需的輔助因子，當(dāng)其合成受阻，導(dǎo)致GPX4活性降低，細(xì)胞抗氧化能力降低，促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生[16]。谷胱甘肽表現(xiàn)出的抗氧化作用用于AD藥物的研發(fā)[17]。與其結(jié)果不一致，我們發(fā)現(xiàn)GPX4、SLC7A11蛋白在PSEN1p.G378E敲入的AD小鼠海馬中表達(dá)增加，可能提示GPX4和SLC7A11蛋白起到保護(hù)作用。目前鐵死亡與AD的研究相對(duì)較少。ZHAGN等[18]對(duì)P301S tau轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，α-硫辛酸可降低鐵沉積、脂質(zhì)過氧化、炎癥反應(yīng)、tau磷酸化，從而改善小鼠的學(xué)習(xí)認(rèn)知能力。通過建立APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型[19],使用鐵螯合劑處理，表現(xiàn)出明顯的腦保護(hù)作用并改善神經(jīng)功能，表明鐵死亡參與AD的發(fā)病過程。ACSL4、PEBP1、GPX4和SLC7A11蛋白具體如何發(fā)揮作用影響AD的發(fā)生，這尚需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鐵死亡相關(guān)蛋白（GPX4、SLC7A11、ACSL4、PEBP1）在PSEN1p.G378E敲入的 AD小鼠海馬組織中的表達(dá)增加 （與正常小鼠相比），暗示鐵死亡與AD有著或多或少的聯(lián)系，但是其詳細(xì)機(jī)制尚不清楚，對(duì)于鐵死亡相關(guān)蛋白如何發(fā)揮作用促進(jìn)AD的發(fā)生發(fā)展值得我們更進(jìn)一步的研究，為AD的診斷與治療策略提供可能。