何靜雯，趙 晟，岳慶春，吳月燕*

(1.上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；2.浙江萬里學院 生物與環(huán)境學院，浙江 寧波 315100)

【研究意義】葡萄(Vitisvinifera)為多年生木質(zhì)藤本植物，是世界上最廣泛種植的果樹樹種之一，遍布于歐、亞及格陵蘭[1]?！醇t’葡萄為寧波地區(qū)設(shè)施栽培特有品種，由優(yōu)良變異單株選育而來，屬歐美雜交種。該葡萄品種的栽培主要采用簡易型日光溫室，可抵御環(huán)境污染和臺風等不良氣候的影響，但室內(nèi)環(huán)境通常具有透光量低、光質(zhì)差等特點[2]，所以部分葡萄會因采光不足進而產(chǎn)生弱光脅迫。大量研究證明，光照不足會嚴重影響植物的產(chǎn)量和品質(zhì)，進而影響其生理生化過程及形態(tài)建成[3-4]。植物在長期進化過程中會形成一系列的自我保護機制以抵御脅迫環(huán)境的傷害[5]，弱光環(huán)境下，植物凈光合速率與CO2羧化效率均會受到影響, 葉綠體也會出現(xiàn)數(shù)目減少、色素含量降低等現(xiàn)象[6]。其次，植株電子傳遞受阻、光呼吸下降、碳同化酶活性降低也是植物對弱光脅迫的響應(yīng)特征之一[7]。【前人研究進展】近年來，植物抗逆基因的研究也成為眾多植物領(lǐng)域的熱門，多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)是植物體內(nèi)廣泛存在的一種氧化還原酶[8]，在植物的研究中發(fā)現(xiàn)PPO基因在脅迫環(huán)境下上調(diào)表達[9]；光敏色素E(Phytochrome E，PhyE)是雙子葉光敏色素家族中的一員，對逆境環(huán)境有很強的適應(yīng)能力[10]。因此，弱光響應(yīng)的分析與測定是植物生理生化研究的關(guān)鍵[11]。但是目前，國內(nèi)外有關(guān)弱光的研究多是從弱光脅迫對植物的光合作用、同化力的形成等方面入手，且主要集中在茄子、番茄、辣椒等蔬菜作物上[12-13]，對葡萄耐弱光機理、光合作用關(guān)鍵酶以及PPO與PhyE基因?qū)θ豕饷{迫的影響研究相對較少?！颈狙芯壳腥朦c】本研究闡述了不同弱光條件對葡萄的生長形態(tài)、光合作用指標、光合作用相關(guān)酶以及PPO與PhyE基因表達量的影響，【擬解決的關(guān)鍵問題】為今后葡萄相關(guān)品種的光照管理及品種推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2017年6-7月在浙江萬里學院生物與環(huán)境學院植物培養(yǎng)室內(nèi)進行，溫度恒定在38℃左右，相對濕度65 %。供試品種為150株長勢均勻的一年生盆栽‘鄞紅’葡萄幼苗，植株修剪和肥水管理參照吳月燕等[14]的方法。以遮陽網(wǎng)和塑料薄膜為覆蓋材料進行遮蔭處理，遮蔭程度設(shè)置5個水平,即 CK(遮光率為0、光照強度28 000 lx)、T1(遮光率25 %、光照強度約22 000 lx)、T2(遮光率40 %、光照強度約17 000 lx)、T3(遮光率70 %、光照強度約10 000 lx)、T4(遮光率85 %、光照強度約5000 lx)。在遮蔭處理后的0、10、20、30 d觀察并采樣，進行各種理化指標的測定，每組指標均重復3次并取平均值。

1.2 試驗方法

1.2.1 ‘鄞紅’葉片生長指標及葉片色素含量的測定 每處理組隨機選取5株，將根部和葉片完整剪下，采用LA-S全能植物圖像分析系統(tǒng)(廣州深華公司)測定根系長度、直徑、表面積、葉面積。采用丙酮提取法[15]稱取0.2 g葉片，加入少量石英砂、80 %丙酮研成勻漿,靜置2～3 min后定容到25 mL。測定提取液在665、649、470 nm波長下的吸光度值并分別計算出葉綠素和類胡蘿卜素含量。

1.2.2 光合氣體交換參數(shù)及響應(yīng)曲線的測定 采用GIRAS-3光合儀(美國PP Systems公司)于12:00-14:00左右充足陽光下測定葉片凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)。儀器設(shè)定溫度為25 ℃,相對濕度(RH)65 %～85 %，每個處理隨機選取5片葉，重復3次取均值。光響應(yīng)曲線用紅藍光源light-curve測定，CO2濃度設(shè)定為(400 ± 10) μmol·m-2s-1,光合有效輻射梯度設(shè)定為0、25、75、100、150、200、500、800、1000、1200、1500和2000 μmol·m-2s-1；CO2響應(yīng)曲線測定選擇A-CI Curve曲線測定,葉室CO2梯度設(shè)定為 50、100、150、300、400、500、600、800、1000、1200和1500 μmol·m-2s-1光強設(shè)定為為1000 μmol·m-2s-1。

1.2.3 乙醇酸氧化酶活性的測定 采用Solaribio公司試劑盒(BC2015)測定葉片中乙醇酸氧化酶(Glycolate oxidase，GO)活性，計算公式如下：GO(nmol/min/g)=ΔA/(ε×d)×V反總/(W×V樣/樣總)/T= 392×ΔA/W，其中：ε為乙醛酸苯腙毫摩爾消光系數(shù)，17 L/mmol/cm；d：比色皿光徑,1 cm；V反總：反應(yīng)總體積，mL；V樣:反應(yīng)中樣本體積，mL；V樣總：加入提取液體積，mL；W：樣本質(zhì)量g；T：反應(yīng)時間，min。

1.2.4 核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose bisphosphate carboxylase oxygenase, Rubisco)與Rubisco活化酶(RCA)活性的測定 按照GMS16015和GMS16016試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)說明書提取葉片中Rubisco與RCA，并分別計算其活性值。

1.2.5 ‘鄞紅’發(fā)育時期光合作用相關(guān)基因表達量測定 遮蔭處理30 d后，測定葡萄葉片在不同遮蔭程度下PPO與PhyE基因表達量的變化。按照植物總RNA提取試劑盒(OMEGA公司，R6827-01)說明書提取葉片總RNA。采用NanoDropTM 2000分光光度計(Thermo Fisher, USA)測定總RNA的質(zhì)量和純度，1.5 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。吸光度OD260/280值在1.9～2.1之間、電泳有3條亮帶且28s條帶亮度大約是18s 2倍的總RNA為高質(zhì)量RNA，可進行cDNA第一鏈合成實驗。以提取的高質(zhì)量總RNA為模版，使用SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒(SuperRT cDNA Kit CW0741, CWBIO，China)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，具體操作步驟按說明書進行。

表1 弱光脅迫對‘鄞紅’葉片生長特性的影響

注：字母代表差異顯著(P<0.05)。

Notes: Letters indicate a significant difference at 0.05 level.

根據(jù)已報道的葡萄PPO(NW_003724172.1)和PhyE(NC_012016.3)基因序列，采用Primer軟件分別設(shè)計熒光pcr引物：PPO-F：ATAACTTCCCCATCAGGACCTACCC和PPO-R：AAATACCGCCAAAGT CTAATGCTGC，PhyE-F：AACTTACCCTCTATTTTGGTGCCTT和PhyE-R：ATTTTGGTGCCTTTAGTGGGC CTAG。以葡萄β-Actin為內(nèi)參基因設(shè)計引物，Actin-F：ATTGTGCTTAGTGGTGGGTGG，Actin-R：GATTTCCTTGCTCATTCTGTC。數(shù)據(jù)處理采用相對值2-△△Ct進行計算，用 GraphPrism7.0處理數(shù)據(jù)和作圖，SPSS23.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，LSD法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 弱光脅迫對‘鄞紅’葉片生長特性的影響

由表1所示，試驗過程中T1葉片生長狀況良好，差異不顯著(P>0.05)，T2與T3生長狀況下降明顯，葉片出現(xiàn)少量黃斑和脫落，但仍然能夠繼續(xù)生長(P>0.05)，其中葉面積會隨著弱光脅迫的增加而變大。但隨著遮蔭程度進一步加強，T4葉片出現(xiàn)大量黃斑和脫落，生長嚴重受阻，各項指標均顯著低于對照組(P<0.05)。因此，一定程度的遮蔭有利于葉片生長。

圖1 弱光脅迫下‘鄞紅’葡萄葉片光合氣體交換參數(shù)含量的變化Fig.1 Changes of photosynthetic gas exchange parameters in ‘Yinhong’ grape leaves under weak light stress

圖2 弱光脅迫下‘鄞紅’葡萄葉片凈光合速率與光合-CO2響應(yīng)曲線Fig.2 Static photosynthetic rate and photosynthetic-CO2 response curve of ‘Yinhong’ grape leaves under weak light stress

2.2 弱光脅迫對‘鄞紅’葉片光合氣體交換參數(shù)的影響

從圖1可以看出，不同處理組間的光合特性隨處理時間的增長變化顯著，不同處理下葡萄葉片凈光合速率變化總體表現(xiàn)為：CK>T1>T2>T3>T4。蒸騰速率與光合速率密切相關(guān)，是植物水分吸收和物質(zhì)運輸?shù)闹饕獎恿16]。本研究發(fā)現(xiàn)弱光脅迫下‘鄞紅’葡萄葉片的凈光合速率(Pn)與蒸騰速率(Tr)在處理期間持續(xù)下降，處理結(jié)束后分別下降了71.6 %和51.9 %，均顯著低于對照組(P<0.05)，由此證明，光合作用和蒸騰作用的變化呈正相關(guān)。弱光下植株葉片胞間CO2濃度(Ci)與氣孔導度(Gs)在T1與T2下均顯著增加(P<0.05)，T1相比CK濃度(Ci)上升了18.0 %，T2比CK高出19.1 %；氣孔導度(Gs)的變化則更加明顯，處理結(jié)束后，T1與T2均上升了91.0 %(P<0.05)，但光合特性也會隨著遮蔭強度的增大而顯著降低，T3與T4的Ci與Gs含量分別下降了7.6 %、17.4 %和22.7 %、36.4 %。

2.3 弱光脅迫下‘鄞紅’葉片片凈光合速率與光合-CO2響應(yīng)曲線

從圖2可以看出，隨著光合有效輻射(PAR)的增加,葡萄葉片的Pn值逐漸升高,當光合有效輻射達到1000 μmol·m-2s-1左右時，凈光合速率的趨勢逐漸趨于平緩。CK組的凈光合速率最高，但同時與對照相比，T1相對于其它處理組對光的利用能力最強,適合在單層遮蔭環(huán)境中生長。其次，‘鄞紅’葉片光合-CO2響應(yīng)曲線可以看出，CO2濃度達到400 μmol·m-2s-1左右時，葉片凈光合速率迅速升高,當CO2濃度在50 μmol·m-2s-1以下時，植株光合產(chǎn)物的積累為負值；同時，CK與4個處理的Pn值隨CO2濃度的升高持續(xù)增長。由此證明‘鄞紅’葡萄是喜光植物，且對高濃度 CO2環(huán)境適應(yīng)能力較強。

2.4 弱光脅迫對‘鄞紅’葉片細胞色素的影響

由圖3顯示，弱光環(huán)境下T1與T2葉綠素含量均為先升高后維持在穩(wěn)定狀態(tài)，遮蔭結(jié)束后分別比CK上升了63.5 %和70.6 %，均顯著高于對照(P<0.05)；但T3與T4的葉綠素含量卻隨著處理天數(shù)的增加而顯著降低，試驗結(jié)束后與對照相比分別下降了60.2 %和68.2 %，均顯著低于對照(P<0.05)。在T1與T2處理下，‘鄞紅’葡萄葉片的類胡蘿卜素含量隨著時間的變化積累，處理結(jié)束后相比對照上升62.5 %和89.4 %，但T3與T4相比對照組類胡蘿卜素含量變化不顯著(P>0.05)。

弱光脅迫下葉片Chl a/Chl b隨脅迫天數(shù)的增加呈下降趨勢,葉片中Chl b大于Chl a,通過增加 Chl b含量提高對藍紫光的利用率以適應(yīng)脅迫環(huán)境。與CK相比,遮蔭結(jié)束后‘鄞紅’葉片的Chl a/Chl b含量從T1～T4分別降低了4.4 %、4.1 %、10.4 %和14.1 %。

圖3 弱光脅迫下‘鄞紅’葡萄葉片細胞色素含量的變化Fig.3 Changes of cytochrome content of‘Yinhong’grape leaves under weak light stress

2.5 弱光脅迫對‘鄞紅’乙醇酸氧化酶活性的影響

由圖4顯示，GO的活性隨遮蔭程度的增加呈逐漸上升的趨勢，處理結(jié)束后T1相比CK略微下降0.7 %，處理前后差別甚微。T2處理后，GO值逐漸上升，相比CK增加了26.8 %，處于顯著水平。隨著遮蔭程度的增加T3與T4乙醇酸氧化酶的活性顯著升高，分別比對照組增加了51.8 %和55.4 %。由此得出，葡萄在重度遮蔭下，光呼吸作用下降，但T1處理下，GO活性略有降低，適度遮蔭有利于減少葉片內(nèi)有害物質(zhì)的累積，適宜植株生長。

2.6 弱光脅迫對‘鄞紅’Rubisco與RCA活性的影響

由圖5顯示，遮蔭結(jié)束后，‘鄞紅’葡萄葉片Rubisco活性與凈光合速率的變化趨勢一致，弱光脅迫下Rubisco活力逐漸下降,T1～T4相比CK分別下降了41.6 %、47.0 %、50.6 %和57.2 %，均達到顯著水平(P<0.05)，同時RCA活性變化同Rubisco變化趨勢基本一致,處理結(jié)束后分別比對照組下降了24.3 %、32.4 %、40.5 %和48.6 %(P<0.05)。Rubisco是光合碳同化的關(guān)鍵酶,直接影響光合速率的大小[17]。本研究表明，Rubisco活性的大小與凈光合速率(Pn)具有高度一致性，弱光影響Rubisco活性，繼而嚴重影響光合速率，這與煙草Rubisco活性對光合速率的響應(yīng)研究結(jié)果一致[18]。

圖4 弱光脅迫下‘鄞紅’葡萄葉片乙醇酸氧化酶(GO)活性的變化Fig.4 Changes of glycolic acid oxidase (GO) activity in ‘Yinhong’ grape leaves under weak light stress

2.7 PPO與PhyE基因表達量分析

由圖6表明，通過遮蔭處理對‘鄞紅’葡萄葉片PPO與PhyE基因表達發(fā)現(xiàn)，與CK相比，PPO基因的表達量呈先升高后降低的趨勢，處理結(jié)束后對照組與組間差異顯(P<0.05)，T1處理下PPO基因表達量上升，說明適度遮蔭會通過PPO基因上調(diào)表達來抵御脅迫環(huán)境，但隨著遮蔭程度的增強基因表達量也逐漸降低。另一基因PhyE表達量隨遮蔭程度的增加而下降，與對照組相比，4個處理組中PhyE基因表達量依次降低，差異均顯著(P<0.05)。這與上述中凈光合速率的變化一致，由此證明植物細胞會因弱光脅迫的增強而受損，導致無法合成PhyE。

圖5 弱光脅迫下‘鄞紅’葡萄葉片Rubisco與RCA活性的變化Fig.5 Changes of Rubisco and RCA activity in ‘Yinhong’ grape leaves under weak light stress

圖6 弱光脅迫下PPO與PhyE基因表達量的變化Fig.6 Relative expression of PPO and PhyE under weak light stress

3 討 論

光是植物生長發(fā)育過程中的重要因子，通常弱光處理下的植物會出現(xiàn)葉片變薄、葉色變淺、葉面積增加、細胞色素含量降低等現(xiàn)象[6]。在‘鄞紅’幼株的研究中發(fā)現(xiàn)，脅迫環(huán)境下會使植株根系生長受阻，發(fā)育遲緩、葉面積轉(zhuǎn)而減小[14]。葡萄的成熟期在每年8月期間，易受到高溫、高濕、CO2濃度等氣候條件的影響，光合速率的大小、凈光合速率與CO2植物對弱光的利用能力直接體現(xiàn)出光合作用的強弱[19]，例如在高溫下同時增加CO2的濃度,會效促進黃瓜葉片的光合作用,增加黃瓜的產(chǎn)量[20]。而光合速率降低的原因可分為氣孔限制因素和非氣孔限制因素[21]。葉綠素在光合作用中起著吸收和轉(zhuǎn)換光能的作用,類胡蘿卜素可以穩(wěn)定葉綠素分子[22]。Chl a/Chl b比值的降低有利于吸收環(huán)境中的紅光而維持PSI和PSII之間的平衡[23]。本研究表明，‘鄞紅’在弱光下通過使植株葉面積增加抵御弱光脅迫對葉片的傷害，弱光下光補償點較低,光飽和、CO2補償點及飽和點較高，這同時與種培芳對甜瓜的研究結(jié)果一致[24]。處理中Pn、Gs、Tr隨脅迫程度的升高而減弱，這可能是由于弱光脅迫下葉片氣孔器變短、氣孔開度變小限制光合作用的進行，氣孔限制是植株光合速率降低的主導因素。但后期Ci隨Pn的降低轉(zhuǎn)而升高，光合速率下降又是由非氣孔因素限制，這與孫建磊等對黃瓜的研究大致相當[25]。另外，T1與T2處理下，葡萄葉片葉綠素與類胡蘿卜素的含量上升,重度脅迫下又會導致葉綠體受損，這與弱光脅迫下頡建明等對辣椒的研究結(jié)果一致[26]。綜上所述，該葡萄品種對輕微弱光環(huán)境有良好的抗性，能夠適宜種植的范圍較廣。

乙醇酸氧化酶(GO)與Rubisco都是植物光合作用過程中的關(guān)鍵酶，Rubisco 活化酶(RCA)更是與 Rubisco 活性關(guān)系緊密,它們之間協(xié)同作用使光合速率保持平衡[27]。光呼吸的下降會造成有毒物質(zhì)(如乙醇酸、H2O2)的積累[28]，光對于乙醇酸氧化酶活性的影響存在諸多假說，但由于試驗材料、品種間的差異、環(huán)境因子等不同，結(jié)果并不一致。乙醇酸氧化酶活性會受到溫度、濕度、光照等共同作用的影響。前人對葡萄的研究證明凈光合速率的下降并不等同于光呼吸的增加[14]；另外，外源施入甲醇會影響棉花乙醇酸氧化酶的活性，凈光合速率升高[29]。此外，光合作用過程中 Rubisco與Rubisco活化酶(RCA)呈正相關(guān)，RCA能夠降低氨基甲酰化所需要的CO2濃度并提高Rubisco活性。對于水稻的研究發(fā)現(xiàn)，胞間 CO2濃度很低時RCA的升高并不能提高水稻的光合速率；隨著CO2濃度的提高，光合速率才會隨RCA的上升而增大,所以只有當胞間 CO2濃度和RCA活性都很高時才能有效提高光合效率[30]。在本研究中發(fā)現(xiàn)凈光合速率持續(xù)下降，但乙醇酸氧化酶活性在T2處理后顯著上升，Rubisco與RCA活性均隨遮蔭程度的降低持續(xù)下降，說明二者協(xié)同作用，遮蔭不利于Rubisco與RCA的同時生成。由此可見，影響光合作用相關(guān)酶活的因素并不是單一的，對于其機制今后還需進一步深入研究。

通過對PPO和PhyE在‘鄞紅’葡萄中基因表達量測定中發(fā)現(xiàn)，低度弱光脅迫下，植物會通過合成PPO來抵御弱光脅迫，PhyE基因表達量隨脅迫程度的升高而降低。但目前對于PPO的研究機理還不夠深入，有學者認為PPO參與葉綠體能量轉(zhuǎn)移，通過調(diào)節(jié)光氧化反來抵御逆境脅迫[31]。雙子葉植物家族中PhyE與PhyB有很高的相似性，PhyB調(diào)節(jié)紅光照射下的大多數(shù)反應(yīng)[32]。擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，PhyB會通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達調(diào)控氣孔開閉[10]；Liu等對水稻的研究表明，PhyB超表達會使水稻葉面積變小、蒸騰速率降低[33]。這可能是植物通過控制PhyE的含量調(diào)節(jié)氣孔開閉從而適應(yīng)脅迫環(huán)境，但重度弱光脅迫下植物會因細胞受損而無法合成PhyE[34]。因此這2個基因與‘鄞紅’弱光抗逆性、氣孔導度、蒸騰速率、葉綠素含量存在著密切聯(lián)系。本課題組驗證了葡萄遮光結(jié)束后，各個處理組之間基因含量的變化，而關(guān)于整個生長期間PPO和PhyE在弱光脅迫下的表達量，以及PhyB與PhyE基因家族之間的關(guān)系，需后續(xù)進一步驗證。

4 結(jié) 論

寧波地區(qū)夏季光照充足、溫度恒定，遮蔭T1(25 %、22 000l x)處理下比較有利于‘鄞紅’葡萄的生長，抗性較高。但弱光并不是影響葡萄光和特性的唯一因素，葉片的光和特性及相關(guān)酶活性在整個試驗處理中還會受到多重的影響。今后的研究可以從以下幾個方面進行拓展：①對‘鄞紅’光合速率的研究要可以具體到T1處理下，光和日變化的某一時間段，以便最大限度提高光能利用率。②進一步分析光敏色素家族在葡萄中的表達量以及各個基因之間的同源相似性。③在弱光脅迫的基礎(chǔ)上，可以加入高溫、高濕、鹽脅迫、重金屬脅迫等雙重或三重影響因子，為多抗葡萄品種的選育提供有力支持。