向紅英，蘭小松，呂延成

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 生物化學(xué)教研室，廣東 珠海 519040)

Ⅱ型單純皰疹病毒(herpes simplex virus 2，HSV-2)是一種具有包膜的DNA病毒，是造成皮膚、黏膜和神經(jīng)等外胚層慢性感染和經(jīng)常性生殖器潰瘍的主要病毒之一[1]，利用短發(fā)卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)可以干擾HSV-2基因的表達(dá)[2-5]。本研究利用帶有多個啟動子的表達(dá)質(zhì)粒，針對HSV-2的UL27和UL54構(gòu)建了一種可同時表達(dá)雙短發(fā)卡RNA(Duo-shRNA)的重組載體，通過與單-shRNA重組表達(dá)載體進行比較，探討其對HSV-2病毒復(fù)制的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 HSV-2333病毒株標(biāo)準(zhǔn)品購于廣州博特生物技術(shù)公司，人胚腎293細(xì)胞株(HEK293)和E.coliDH5α由本校區(qū)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室提供，帶有多個啟動子的pGenesil10-3p質(zhì)粒(見圖1)及用于表達(dá)shRNA的寡核苷酸鏈由武漢市淅瑪生物技術(shù)有限公司提供并進行連接構(gòu)建。 限制性內(nèi)切酶BbsI、BamH I和PstI、TRIzol試劑購自日本Takara公司，SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自日本Toyobo公司，新生牛血清購自中國杭州四季青公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒購自中國杭州愛思進生物技術(shù)有限公司，HSV-2 gB和ICP27抗體分別購于美國Santa Cruz Biotechnology公司和Abcam公司，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒和DMEM分別購自美國Invitrogen公司和Gibco公司。

主要儀器有產(chǎn)自中國蘇州凈化設(shè)備廠的YJ-1450型醫(yī)用凈化工作臺，德國徠卡公司的Elx-800型全自動酶標(biāo)儀，德國eppendorf公司的5810R臺式冷凍離心機及美國SHEL公司的CO2培養(yǎng)箱等。

圖1 pGenesil10-3p質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

1.2 方法

1.2.1 HSV-2UL27、UL54干擾靶位點的選擇和shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 從GenBank上檢索HSV-2(NC_001798)UL27和UL54編碼序列，參照shRNA設(shè)計原則，對其保守區(qū)域序列進行篩選，合成干擾靶序列，采用pGenesil10-3p質(zhì)粒分別構(gòu)建表達(dá)單、雙shRNA的表達(dá)載體。另構(gòu)建兩條不干擾任何基因的隨機序列作為陰性對照組(Negative control,NC)。選擇的干擾基因靶序列及構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)載體(見表1)。

表1反義靶點的DNA模板序列

序列名稱序列 靶點UL27-shRNAGAACCATGTTGGTGACCTTGG75-95UL54-shRNAGCGTGGTGCAAGATGTGCATT1081-1101Duo-shRNAGAACCATGTTGGTGACCTTGGGCGTGGTGCAAGATGTGCATTNC-shRNAGTATGACAACAGCCTCAAGTGTATGACAACAGCCTCAAGGRandom sequence

1.2.2 HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 HEK293在37 ℃，5% CO2條件下，在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM完全培養(yǎng)液中按常規(guī)方法進行培養(yǎng)(下同)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中(每孔約4×104～5×104個細(xì)胞)。實驗分為NC-shRNA(陰性對照組)、空載體(空白對照組)和干擾組；干擾組包括：單干擾組(UL27-shRNA和UL54-shRNA組)、單干擾聯(lián)合組(UL27-shRNA+UL54-shRNA)和Duo-shRNA組，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h至細(xì)胞生長至一定豐度后，分別取上述構(gòu)建的單、雙shRNA表達(dá)質(zhì)粒配制質(zhì)粒轉(zhuǎn)染混合物(質(zhì)粒與Lipofectamin2000比為0.8 μg：2 μL)，每孔細(xì)胞中加入100 μL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染混合物后再培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況。

1.2.3 HEK293細(xì)胞接種病毒 HSV-2在HEK293中進行擴增培養(yǎng)，收集病毒并用終點滴定法檢測病毒滴度，HSV-2的滴度用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)表示。1.2.2中的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，去掉細(xì)胞上清后加入TCID50為10-5.25/0.1 mL的病毒懸液100 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h后去掉病毒液，后加入2% DMEM進行培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞上清液進行病毒滴度檢測，收集細(xì)胞提取總RNA和總蛋白進行mRNA和靶蛋白分析。

1.2.4 子代病毒滴度的測定和細(xì)胞存活率檢測 收集各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清液，同上用終點滴定法測定上清病毒滴度并計算各組TCID50，剩余的細(xì)胞用MTT法測定細(xì)胞存活率，以檢驗表達(dá)的siRNA對HSV-2復(fù)制的抑制效果。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測靶基因mRNA的表達(dá)水平 抽提細(xì)胞總RNA，用DNase Ⅰ去除非特異性DNA片段并檢測RNA純度和完整性，采用隨機引物法進行反轉(zhuǎn)錄，實時熒光定量PCR儀進行PCR 擴增。UL27上游引物：5'-CAAAGACGTGACCGTGTCGCAG-3'，下游引物：5'-GCGGTGGTCTCCATGTTGTTCC-3'；UL54上游引物：5'-CCAGGACCCTATCATCGGAACG-3'，下游引物：5'-AGTATTTCAATGAGACCCGCCAT-3'；內(nèi)參GAPDH上游引物：5'- AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物：5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。引物由上海生物工程公司合成，PCR參數(shù)為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s；72 ℃ 32 s，共42個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，△△比較法計算各組UL27和UL54 mRNA的相對表達(dá)量并計算對靶基因表達(dá)的抑制率。

相對mRNA表達(dá)量 =(Ct靶基因- Ct內(nèi)參)干擾組-(Ct靶基因- Ct內(nèi)參)對照組。

mRNA抑制率(%)=(1-干擾組相對mRNA表達(dá)量/對照組相對mRNA表達(dá)量)×100%。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測gB和ICP27蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量分析。12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，電轉(zhuǎn)移法將電泳蛋白條轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加入一抗4 ℃孵育12 h，漂洗后加入二抗，37 ℃作用40 min。用ECL試劑盒對WB條帶進行化學(xué)熒光顯色，X線膠片經(jīng)ImageJ圖像分析軟件對蛋白條帶進行定量分析。gB和ICP27蛋白表達(dá)量以管家基因表達(dá)的蛋白(GAPDH)為參照計算。并按如下公式計算：相對表達(dá)量(%)= 目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值×100%。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞上清液中病毒滴度 接種病毒48 h后檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清病毒滴度(見表2)。其中NC-shRNA與空白對照組無差異(P>0.05)，單、雙-shRNA表達(dá)載體與空白對照相比均能使細(xì)胞上清液中的病毒滴度降低(P<0.05)，且單干擾聯(lián)合組(UL27-shRNA +UL54-shRNA)和Duo-shRNA組比單干擾組降低病毒滴度的效果更好(P<0.05)，表明對于雙基因的干擾能夠更有效的抑制HSV-2的復(fù)制，但單干擾聯(lián)合組與雙干擾組之間對于病毒滴度的影響無顯著性差異(P>0.05)。

表2接種48 h后各試驗組HSV-2病毒滴度

組別HSV-2 病毒滴度/100 μL空白對照10-6.2±0.3NC-shRNA10-6.3±0.3UL27-shRNA10-3.2±0.3 ?UL54-shRNA10-3.4±0.1 ?UL27-shRNA +UL54-shRNA10-2.0±0.2 ?△#Duo-shRNA10-2.2±0.3 ?△#※

*:P<0.05,與空白對照組相比; △：P<0.05,與UL27-shRNA相比; #：P<0.05,與UL54-shRNA相比; ※：P>0.05,與UL27-shRNA+UL54-shRNA相比。

2.2 細(xì)胞存活率 通過MTT法檢測各實驗組細(xì)胞存活率(見圖2)。NC-shRNA組與空白對照相比無顯著差異(P>0.05)，單、雙-shRNA干擾組與NC-shRNA組相比均有顯著差異(P<0.05)，且干擾聯(lián)合組和Duo-shRNA組的細(xì)胞存活率明顯高于單干擾組(P<0.05)，但干擾聯(lián)合組與Duo-shRNA組比較無顯著差異(P>0.05)。表明采用shRNA干擾技術(shù)能夠提高細(xì)胞的存活率，而且對于雙基因的同時干擾會更有效。

*：P<0.05,與陰性對照組相比; #：P<0.05,與Duo-shRNA相比; △：P<0.05,與UL27-shRNA,UL54-shRNA相比; ※：P>0.05,與UL27-shRNA+UL54-shRNA。圖2 MTT法測定HEK293細(xì)胞存活率

2.3 靶基因 mRNA的抑制效率 從接種HSV-2病毒48 h后計算得出各實驗組靶基因mRNA表達(dá)抑制率(見表3)。單、雙-shRNA干擾組與空白對照相比均具有顯著性差異(P<0.05)，表明單、雙-shRNA表達(dá)載體均能在一定程度上干擾其靶mRNA的表達(dá)；且單干擾組對UL27mRNA和UL54 mRNA抑制率明顯低于干擾聯(lián)合組和Duo-shRNA組(P<0.05)，表明對多個靶基因的干擾能夠在mRNA水平上降低每一個基因的表達(dá)量；而干擾聯(lián)合組與Duo-shRNA組之間對UL27、UL54 mRNA抑制率無顯著差異(P>0.05)。

表3各試驗組UL27、UL54 mRNA抑制率

組別UL27mRNA抑制率(%)UL54mRNA抑制率(%)Blank control——NC-shRNA33UL27-shRNA65?—UL54-shRNA—72?UL27-shRNA+UL54-shRNA85?△81?#Duo-shRNA84?△※88?#※

*：P<0.05,與空白對照組相比；△：P<0.05,與UL27-shRNA相比; #：P<0.05,與UL54-shRNA相比; ※：P>0.05,與UL27-shRNA+UL54-shRNA相比。

2.4 靶基因蛋白表達(dá)水平 采用Western blot檢測UL27編碼的gB蛋白和UL54編碼的ICP27蛋白表達(dá)水平(見圖3～4)。從實驗結(jié)果可以看出，

*：P<0.05,與陰性對照組相比；△：P<0.05,與UL27-shRNA相比; #：P<0.05,與UL54-shRNA相比。圖3 Western-blot檢測gB蛋白表達(dá)水平

*：P<0.05,與陰性對照組相比；△：P<0.05,與UL27-shRNA相比; #：P<0.05,與UL54-shRNA相比。圖4 Western-blot檢測 ICP27蛋白表達(dá)水平

各shRNA干擾組與NC-shRNA組相比gB和ICP27蛋白的表達(dá)都明顯降低(P<0.05)，表明無論是對兩個靶基因還是對其中的任何靶一個基因干擾，都會影響到靶蛋白的表達(dá)；干擾聯(lián)合組和Duo-shRNA組與單基因干擾組相比，降低靶蛋白的效果更為明顯(P<0.05)，表明雙基因的干擾優(yōu)于單基因的干擾，但干擾聯(lián)合組和Duo-shRNA組之間無顯著差異(P>0.05)。數(shù)值用靶蛋白GAPDH條帶的灰度值表示。

3 討論

實驗利用帶有多個不同啟動子的框架，在hU6啟動子后連接針對UL27的shRNA表達(dá)序列，同時在hH1啟動子后連接針對UL54的shRNA表達(dá)序列，構(gòu)成反式表達(dá)雙shRNA的表達(dá)載體質(zhì)粒，構(gòu)建經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后再感染病毒，通過對細(xì)胞存活率、子代病毒滴度、靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果表明，這種串聯(lián)反式雙shRNA的表達(dá)載體，在抑制HSV-2復(fù)制、干擾靶基因的表達(dá)，提高對宿主HEK293細(xì)胞保護作用方面都明顯優(yōu)于單-shRNA表達(dá)載體，并可以達(dá)到利用兩個單-shRNA表達(dá)載體相同的干擾效果。雖然利用化學(xué)合成的siRNA導(dǎo)入細(xì)胞或載體介導(dǎo)shRNA的方式產(chǎn)生RNAi[6-7]取得不錯的效果，但對病毒成功實施RNAi的關(guān)鍵是如何使細(xì)胞內(nèi)的siRNA具有長期持久的作用以及對病毒基因發(fā)揮有效的干擾作用，然而化學(xué)合成的siRNA 所致的基因沉默具有暫時性的特點，使其在抑制病毒復(fù)制應(yīng)用上受到一定限制。而使用shRNA序列的表達(dá)載體就能克服這一缺點，shRNA轉(zhuǎn)人細(xì)胞后在Dicer酶作用下轉(zhuǎn)化成siRNA，此方法持續(xù)時間長，但通過產(chǎn)生單個shRNA的方式對病毒的單個基因?qū)嵤└蓴_，很難完全抑制病毒的復(fù)制[3]。因此提高siRNA對病毒基因的干擾效率，可能的途徑之一是對病毒多個靶基因同時實施干擾，針對病毒不同的靶基因構(gòu)建多個shRNA表達(dá)載體，然后同時轉(zhuǎn)染細(xì)胞，表達(dá)產(chǎn)生不同的siRNA。這種由多個shRNA表達(dá)載體實施的聯(lián)合干擾作用可以有效抑制病毒的增值[8]，但該過程需要構(gòu)建不同的shRNA重組表達(dá)載體，并經(jīng)過多步轉(zhuǎn)染，操作繁瑣，而且質(zhì)粒上攜帶的綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)具有的“毒性效應(yīng)”可導(dǎo)致細(xì)胞死亡率增加[9-10]。

因此實施多靶位點RNAi具有一定的優(yōu)勢[11]，利用多啟動子的表達(dá)載體對病毒進行多靶點的基因干擾能夠達(dá)到多基因干擾的目的，不僅能夠提高干擾效率，有效抑制病毒復(fù)制，保護宿主細(xì)胞，同時具有操作簡便易行的特點。雖然現(xiàn)在對這種多基因干擾中病毒基因之間的相互作用和影響的機制還不完全清楚，但它可能成為抑制病毒復(fù)制的一種有效方法。

綜上所述，本文利用雙啟動子的方法構(gòu)建了針對HSV-2的UL27和UL54的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體。并比較了雙shRNA表達(dá)載體和UL27-shRNA+UL54-shRNA聯(lián)合介導(dǎo)的雙基因干擾、UL27-shRNA和UL54-shRNA介導(dǎo)的單基因干擾對抑制HSV-2病毒靶基因mRNA表達(dá)水平以及病毒在HEK293細(xì)胞中增殖。結(jié)果表明雙shRNA對HSV-2病毒的抑制效率較單基因干擾好，同時解決了雙載體雙基因介導(dǎo)基因沉默在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可能出現(xiàn)的載體數(shù)量上的差異和均一性問題。