李芮琳 ，劉文杰，袁 慶 ，張 彤 ，徐 耀，胡利民 ，柴麗娟

（1．天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 300193；2．方劑學教育部重點實驗室，天津 300193；3．天津市中藥藥理學重點實驗室，天津 300193）

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)膠質(zhì)細胞中數(shù)量最多功能最復(fù)雜的一類細胞[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細胞除有維持血管、神經(jīng)元胞體、軸突和突觸結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的功能外[2]，還有分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（CNTF）等的功能[3]。BDNF、GDNF、CNTF 對氧糖剝奪/復(fù)氧（OGD/R）處理后神經(jīng)細胞的存活、分化及神經(jīng)再生、空間認知能力等方面起重要作用，對腦缺血缺氧所致的腦損傷有保護作用，可促進周圍神經(jīng)損傷的軸突生長、髓鞘的形成和突觸形成[4-5]。

心腦舒通膠囊的主要成分為蒺藜總皂苷，具有活血化瘀，舒利血脈等生理活性，主要用于中風恢復(fù)期半身不遂、語言障礙等心腦血管缺血性疾患[6]。本實驗通過建立可靠的體外OGD/R損傷模型，研究心腦舒通對星形膠質(zhì)細胞的影響及對神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響，以及經(jīng)心腦舒通處理的星形膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液對神經(jīng)元存活的影響。初步探討心腦舒通的神經(jīng)保護作用，為臨床用藥提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗細胞 星形膠質(zhì)細胞株C8-D1A（武漢大學細胞保藏中心）；Neuro-2A神經(jīng)元細胞（美國ATCC公司）。

1.2 實驗儀器及試劑 心腦舒通膠囊（吉林敖東有限公司，批號為Z22021965）；MEM培養(yǎng)基（美國Corning公司，批號為10-022-CVR）；胎牛血清（美國 BiologicalIndustries公司，批號為 1552680）；0．25%胰蛋白酶（美國Gibco公司，批號為1894156）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學公司，批號為CK04）；酶免疫吸附（ELISA）試劑盒（武漢華美生物，批號分別為 CSB-E04501h、CSB-E04566r、CSBEL005683CH）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國 Thermo公司）；低溫高速離心機（美國Beckman公司），多功能讀板機（瑞士Tecan公司）；缺氧小室（加拿大Stemcell公司）。

2 方法

2.1 藥物配制 準確稱量心腦舒通膠囊中的藥粉質(zhì)量，用細胞培養(yǎng)液配制成10 mg/mL濃度，用0．75 μm一次性過濾器過濾藥液，之后用細胞培養(yǎng)液稀釋為不同濃度的工作液。

2.2 小鼠膠質(zhì)細胞株C8-D1A、神經(jīng)元細胞株Neuro-2A的培養(yǎng) 復(fù)蘇C8-D1A膠質(zhì)細胞株，MEM全培基（10%胎牛血清；1%丙酮酸鈉；1%雙抗）培養(yǎng)，待細胞生長至匯合后用0．25%胰酶消化傳代。待細胞穩(wěn)定3～4代后用于實驗。每4～5日細胞傳代1次。

復(fù)蘇Neuro-2A神經(jīng)元細胞株，MEM全培基（MEM，10%胎牛血清，1%雙抗，2 mmol/L的L-谷氨酰胺）培養(yǎng)，待細胞生長至匯合后用0．25%胰酶消化傳代。待細胞穩(wěn)定3～4代后用于實驗。每4～5日細胞傳代1次。

2.3 對正常培養(yǎng)膠質(zhì)細胞活力的影響 將生長穩(wěn)定的C8-D1A種植于96孔板，細胞覆蓋約60%時，置換細胞培養(yǎng)液為含有不同濃度心腦舒通（10pg/mL、100 pg/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 μg/mL、10 μg/mL）的無血清 MEM 培養(yǎng)基孵育24 h，培養(yǎng)24 h棄去培養(yǎng)液，加入CCK-8后于450 nm處測定吸光度，記錄數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2.4 對氧糖剝奪/復(fù)氧處理膠質(zhì)細胞活力的影響 將生長穩(wěn)定的C8-D1A種植于96孔板，細胞覆蓋約60%時，棄去原培養(yǎng)液，用無糖KRP緩沖液洗滌細胞2次后加入無糖KRP緩沖液放入缺氧小室中，而后將缺氧小室中充注95%N2+5%CO2，密封放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。4 h后將KRP置換為含有不同濃度心腦舒通（0 pg/mL、10 pg/mL、100 pg/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 μg/mL、10 μg/mL）無血清MEM培養(yǎng)基孵育，0 pg/mL為模型組（Mod）；對照組（Con）用含糖KRP緩沖液清洗細胞2次后，加入含糖KRP緩沖液，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱正常孵育4 h，而后加入無血清全培進行培養(yǎng)。培養(yǎng)20h后棄去培養(yǎng)液，CCK-8法測定細胞活力，多功能讀板機450 nm波長處測定吸光度。

2.5 對體外OGD/R膠質(zhì)細胞神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF、GDNF、CNTF）釋放的影響 將生長穩(wěn)定的C8-D1A細胞種植于24孔板，待細胞覆蓋約80%時，細胞按上述步驟進行OGD/R及加藥處理。48 h后收集細胞上清液，3 000 r/min，15 min，25 ℃離心，吸取上清液于新的200 μL離心管中。參照ELISA試劑盒相關(guān)操作說明進行操作，均在540 nm波長處測定吸光度，記錄數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

此部分膠質(zhì)細胞培養(yǎng)上清液同時也收集備用為膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液，用于后續(xù)對OGD/R神經(jīng)元細胞保護作用的研究。細胞分組如下：正常對照組（Con）、模型組（Mod）、心腦舒通不同濃度組（0．1、1、10 μg/mL）。

2.6 心腦舒通處理C8-D1A細胞條件培養(yǎng)液對OGD/R神經(jīng)元的保護作用 將Neuro-2A細胞用神經(jīng)元完全培養(yǎng)液（MEM，10%胎牛血清，1%雙抗，0．5%L-谷氨酰胺）懸浮，以 6．25×104個/cm2接種于96孔板中，待細胞生長融合約80%時，進行實驗。按2．3步驟對Neuro-2A細胞進行OGD/R處理，模型組在復(fù)氧的同時加入經(jīng)心腦舒通處理過的膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)20 h后，CCK-8法測定神經(jīng)元細胞活力。細胞具體分組如下：正常對照組（Con）、模型組（Mod）、不同濃度心腦舒通處理膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液組（0．1、1 和 10 μg/mL）。

2.7 統(tǒng)計學分析 所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19．0進行統(tǒng)計處理，組間差異性比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 心腦舒通對正常及OGD/R損傷C8-D1A細胞活力的影響 見圖1（A），與對照組相比，心腦舒通在不同濃度范圍內(nèi)對正常培養(yǎng)C8-D1A細胞活力均沒有影響，表明實驗所選用心腦舒通的各濃度對膠質(zhì)細胞均無毒副作用。

見圖1（B），與對照組相比，模型組及心腦舒通不同濃度組均能提高OGD/R損傷C8-D1A細胞的增殖。與模型組相比，心腦舒通在10 μg/mL時對OGD/R損傷的C8-D1A細胞有保護作用。

3.2 對OGD/R損傷的C8-D1A細胞BDNF、GDNF、CNTF合成分泌的影響 從圖2可以看出，與對照組相比，模型組BDNF有少許升高，不同濃度心腦舒通可以顯著促進OGD/R損傷C8-D1A細胞BDNF的釋放。與模型組相比，心腦舒通0．1 μg/mL可以顯著提高膠質(zhì)細胞BDNF的釋放。與對照組相比，模型組膠質(zhì)細胞GDNF、CNTF的分泌釋放有升高趨勢，但不具有統(tǒng)計學差異。與模型組比較，不同濃度心腦舒通對OGD/R損傷C8-D1A細胞BDNF的分泌促進作用也不明顯。

3.3 心腦舒通處理膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液對OGD/R損傷神經(jīng)元的保護作用 從圖3可以看出，與對照組比較，來源于膠質(zhì)細胞模型組的條件培養(yǎng)液顯著降低了OGD/R神經(jīng)元的細胞活力，顯著抑制了神經(jīng)元細胞的活力。而用心腦舒通處理過的膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)缺氧復(fù)氧的神經(jīng)元20 h后，0．1 μg/mL心腦舒通可以明顯提高OGD/R神經(jīng)元的存活能力。

圖2 心腦舒通對OGD/R膠質(zhì)細胞BDNF、GDNF、CNTF釋放的影響（n=6）Fig.2 Effects of Xinnao Shutong on the release of BDNF,GDNF and CNTF from OGD/R astrocytes（n=6）

圖3 心腦舒通處理的膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液對神元細胞的保護作用（n=18）Fig.3 Protective effect of conditioned medium of glial cells treated with Xinnao Shutong on neurons（n=18）

4 討論

神經(jīng)營養(yǎng)因子在缺血性腦損傷的發(fā)生和發(fā)展方面有著重要作用，腦缺血可導致神經(jīng)元凋亡甚至死亡[7]。研究表明，腦缺血再灌注損傷中，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞分泌BDNF、GDNF、CNTF等的能力增強，并通過分泌這些神經(jīng)營養(yǎng)因子來促進神經(jīng)元的修復(fù)和再生[8]。郭大志等[9]通過實驗表明，BDNF可通過抵抗一氧化氮（NO）介導的谷氨酸細胞毒性和抑制細胞凋亡來保護神經(jīng)元，從而減少缺血性腦損傷。GDNF不僅能提高神經(jīng)元抗損傷能力，并且具有促進軸突生長作用[10]。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，CNTF作為促進膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元存活和分化的一種營養(yǎng)因子，對膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元起到保護作用[11]。

從實驗結(jié)果可以看出，心腦舒通對正常培養(yǎng)膠質(zhì)細胞系C8-D1A細胞活力沒有顯著影響，但可以提高OGD/R的膠質(zhì)細胞增殖，其中10 μg/mL時對OGD/R后的C8-D1A膠質(zhì)細胞有明顯促增殖作用。另外，心腦舒通在0．1 μg/mL時可以顯著提高OGD/R后膠質(zhì)細胞BDNF的釋放，而對具有抵抗缺血損傷能力的GDNF、CNTF因子來說，心腦舒通對其釋放量均無顯著影響。從心腦舒通處理的膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液對OGD/R損傷神經(jīng)元的作用結(jié)果看，與對照組比較，模型組條件培養(yǎng)液顯著降低損傷神經(jīng)元的細胞活力，表明星形膠質(zhì)細胞的過度活化可能參與促進缺血后神經(jīng)細胞的損傷過程，從而加重了神經(jīng)細胞的損傷。而心腦舒通在0．1 μg/mL時可以顯著提高損傷后神經(jīng)元的活力，該保護作用有可能是通過膠質(zhì)細胞釋放BDNF而發(fā)揮作用。

總之，本研究表明心腦舒通可以促進OGD/R損傷后的膠質(zhì)細胞增殖及生長因子的釋放，促進OGD/R損傷神經(jīng)元的存活，為臨床治療提供了一些理論依據(jù)，但其機制有待進一步的深入研究。