楊 萍 ，周玉平，夏 晴 ，姚立鵬 ，李高文，常秀春 ，王 鳳

（1．寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，寧波 315100；2．寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，寧波 315020）

心肌缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷是心肌缺血再灌注治療后面臨的治療難題，炎癥因子釋放是H/R發(fā)生的重要因素[1]。血紅素氧化酶-1（HO-1）是近年來發(fā)現(xiàn)的組織保護(hù)酶，已被證實(shí)具有抑制炎癥等多種細(xì)胞保護(hù)功能[2]。黃芪廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療，其主要藥理活性成分黃芪甲苷（AS-Ⅳ），對多種心肌細(xì)胞損傷模型具有顯著的保護(hù)作用，且作用機(jī)制主要與抗氧化、抗炎作用有關(guān)[3-5]，但具體的靶向分子及信號通路尚不十分明確。由于HO-1是最近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性抗氧化酶，已有的研究表明其具有心肌細(xì)胞保護(hù)作用[6]。HO-1是否介導(dǎo)了AS-Ⅳ對H/R損傷心肌的保護(hù)作用值得研究。鑒于HO-1與AS-Ⅳ在細(xì)胞保護(hù)方面存在交集，HO-1可能介導(dǎo)了黃芪甲苷對H/R心肌損傷的保護(hù)作用。本研究分別以AS-Ⅳ、HO-1激動劑原卟啉氯化鈷（CoPP）、HO-1拮抗劑原卟啉Ⅸ鋅（Ⅱ）絡(luò)合物（ZnPP）對H/R損傷的心肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，解析AS-Ⅳ的心肌保護(hù)作用與HO-1之間的關(guān)系，為闡釋AS-Ⅳ抗心肌缺血再灌注損傷提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SD大鼠乳鼠，SPF級，出生1～3 d，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK（京）2016-0011。

1.2 藥物與試劑 AS-Ⅳ（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：170614，純度≥99%）；HO-1激動劑CoPP、HO-1 拮抗劑 ZnPP、四甲基噻唑藍(lán)（MTT，美國Sigma公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國GIBCO公司）；兔抗小鼠GAPDH多克隆抗體、兔抗小鼠HO-1多克隆抗體（Santa Cruz公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒、超敏電致化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（上海碧云天生物工程有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）、心肌肌鈣蛋白（cTnT）、超敏 C 反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 生物潔凈工作臺（蘇州安泰空氣有限公司）、恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）、倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）、多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）、全自動生化分析儀（日本Hitachi公司）、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)Cycler PCR儀（美國Bio-Rad公司）、PCR擴(kuò)增儀（美國Life technology公司）。

2 方法

2.1 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)：取出生1～3 d SD大鼠乳鼠，胰酶消化法將心肌組織逐步分離成單個(gè)心肌細(xì)胞，接種至培養(yǎng)瓶，置于37℃，5%CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，差速貼壁去除成纖維細(xì)胞。調(diào)整純化后的心肌細(xì)胞濃度，接種至6孔板或96孔板中，每24 h更換1次培養(yǎng)液。72 h后細(xì)胞基本融合時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)的心肌細(xì)胞經(jīng)α-橫紋肌肌動蛋白單克隆抗體的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞純度達(dá)95%以上。

2.2 H/R損傷模型的復(fù)制 參照文獻(xiàn)[8]并加以改進(jìn)建立心肌細(xì)胞H/R模型。心肌細(xì)胞置于缺氧裝置中以模擬缺血溶液培養(yǎng)4 h后，再于常氧環(huán)境中換用模擬再灌注溶液培養(yǎng)4 h，即為H/R模型。

2.3 細(xì)胞分組 心肌細(xì)胞懸液調(diào)整濃度后，隨機(jī)分為以下5組：正常對照組、H/R組、AS-Ⅳ組（H/R造模后給予AS-Ⅳ100μmol/L干預(yù)24h）、CoPP組（H/R造模后給予終濃度為20 μmol/L CoPP干預(yù)24 h）、ZnPP組（H/R造模后給予終濃度為20 μmol/L ZnPP干預(yù)24 h）。每個(gè)組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

2.4 MTT檢測細(xì)胞活力 按實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)的處理因素后棄去上清液，每孔加入終濃度為0．5 mg/L MTT 溶液 100 μL，繼續(xù)孵育 4 h后，每孔加入 150 μL二甲基亞砜（DMSO），震蕩10 min，使用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測其吸光度值。

2.5 LDH、cTnT含量的測定 細(xì)胞分組處理后，取細(xì)胞培養(yǎng)液，按試劑盒操作說明檢測LDH、cTnT含量。

2.6 hs-CRP、TNF-α含量的測定 細(xì)胞分組處理后，取培養(yǎng)液，按試劑盒操作說明檢測細(xì)胞上清液中 hs-CRP、TNF-α 含量。

2.7 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測 HO-1蛋白表達(dá) 細(xì)胞分組處理后，收集細(xì)胞并提取總蛋白。取樣品蛋白質(zhì)50 μg，與SDS上樣緩沖液混合，95℃～100℃變性5 min。制膠，上樣，電泳，切膠，半干轉(zhuǎn)膜器恒壓12 V轉(zhuǎn)PVDF膜60 min，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗膜 10 min×3次，以 5%牛血清白蛋白（BSA）/磷酸緩沖鹽溶液（PBS）封閉1 h，加入一抗中4℃輕搖孵育過夜，PBST洗膜10 min×3次，加入二抗室溫輕搖孵育1 h，將膜置于Kodak Image Station 2000MM成像系統(tǒng)曝光，獲取目的條帶圖像。Image J軟件分析灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算HO-1蛋白相對表達(dá)量。

2.8 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測定HO-1mRNA表達(dá) 按實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)的處理后，提取心肌細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。HO-1引物：上游5'-GCTCTATCGTGCTCGCATGA-3'，下游 5'-AATTCCCACTGCCA2CGGTC-3'。GAPDH引物：上游5'-CCTCGTCTCATAGACAAGATGGT-3'，下游 5'-GGGTAGAGTCATACTGGAACATG-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃2 min，95℃變性15 s，60℃延伸退火1 min，40個(gè)循環(huán)。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 20．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示。采用單因素方差one-way ANOVA進(jìn)行方差分析，方差齊時(shí)采用LSD法進(jìn)行組間多重比較，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3法進(jìn)行組間多重比較。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組心肌細(xì)胞活力比較 MTT結(jié)果顯示，與正常對照組比較，H/R組心肌細(xì)胞活力顯著下降（P＜0．05）；與 H/R 組比較，HO-1抑制劑 ZnPP 組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0．05），HO-1 激動劑 CoPP 組則顯著升高（P＜0．05），說明增加 HO-1可減輕 H/R 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。與H/R組比較，AS-Ⅳ組細(xì)胞活力顯著增加（P＜0．05），具有類似 HO-1激動劑樣作用。結(jié)果見圖1。

圖1 各組的細(xì)胞活力Fig.1 Cardiomyocytes viability in each group

3.2 各組細(xì)胞上清LDH、cTnT含量比較 與正常對照組比較，H/R組細(xì)胞上清LDH、cTnT含量顯著增加（P＜0．01）；ZnPP 則顯著加重 H/R 導(dǎo)致的上述指標(biāo)變化；與H/R組比較，CoPP組心肌細(xì)胞LDH、cTnT 含量顯著降低（P＜0．01），說明 HO-1可減輕 H/R導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。與H/R組比較，AS-Ⅳ可顯著降低H/R預(yù)處理后的LDH、cTnT含量，說明AS-Ⅳ具有類似HO-1激動劑樣作用。結(jié)果見圖2。

圖2 各組LDH和cTnT表達(dá)的水平Fig.2 Levels of LDH and cTnT in each group

3.3 各組細(xì)胞上清hs-CRP、TNF-α水平比較 與正常對照組比較，H/R組細(xì)胞上清炎癥因子hs-CRP、TNF-α 表達(dá)顯著升高（P＜0．01）；與 H/R 比較，CoPP組hs-CRP、TNF-α表達(dá)水平顯著降低（P＜0．01），說明HO-1激動劑可減輕H/R導(dǎo)致的炎癥損傷。與H/R比較，AS-Ⅳ可顯著降低hs-CRP、TNF-α表達(dá)水平，說明AS-Ⅳ具有類似HO-1激動劑樣作用。結(jié)果見圖3。

圖3 各組hs-CRP、TNF-α表達(dá)的水平Fig.3 Levels of hs-CRP and TNF-α in each group

3.4 各組細(xì)胞HO-1mRNA、蛋白表達(dá)比較 PCR及Western blot結(jié)果顯示，與正常對照組比較，H/R組 HO-1 mRNA 及蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0．01）；與H/R比較，CoPP組HO-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均進(jìn)一步升高（P＜0．01），ZnPP 組則顯著下降（P＜0．01）。與 H/R 比較，AS-Ⅳ組 HO-1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0．01），具有 HO-1 激動劑CoPP樣作用。結(jié)果見圖4。

圖4 各組AS-Ⅳ、CoPP及ZnPP對缺氧/復(fù)氧預(yù)處理后HO-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 Effects of the mRNA and protein expression levels of HO-1 after H/R intervention by AS-Ⅳ,CoPP and ZnPP in each group

4 討論

HO-1是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，近年來被公認(rèn)為是一種重要組織保護(hù)酶[2]，如藥物誘導(dǎo)HO-1表達(dá)增加可減輕脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞損傷[7]。HO-1對多種心肌損傷模型具有保護(hù)作用，其機(jī)制包括增加一氧化碳（CO）水平，調(diào)節(jié)內(nèi)皮型一氧化氮（eNOS）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）活性，TNF-α、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）水平，減少斑塊炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[8-9]。研究結(jié)果表明HO-1對心肌細(xì)胞H/R損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制炎癥因子表達(dá)有關(guān)。因此，HO-1是治療心肌缺血再灌注損傷一個(gè)很好的干預(yù)靶點(diǎn)，通過各種方式誘導(dǎo)HO-1表達(dá)必然在細(xì)胞保護(hù)方面發(fā)揮重要作用。

根據(jù)患者的臨床特征，中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為心肌缺血再灌注損傷的病機(jī)以心氣虛衰為本，故中醫(yī)治則當(dāng)益氣扶正以固本[10]。黃芪有健脾補(bǔ)中、補(bǔ)氣固表、升陽舉陷等功效，成為中醫(yī)臨床最常用的補(bǔ)氣扶正中藥。AS-Ⅳ是黃芪藥理活性的主要物質(zhì)之一。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)AS-Ⅳ對多種心肌細(xì)胞損傷模型具有顯著的保護(hù)作用，具有增強(qiáng)心肌收縮力、改善心肌能量代謝、抑制心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡作用[3]。本研究通過HO-1激動劑CoPP、HO-1抑制劑ZnPP分別干預(yù)H/R損傷心肌細(xì)胞，驗(yàn)證了HO-1通過抑制炎癥因子表達(dá)對心肌細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用，進(jìn)一步證實(shí)了AS-Ⅳ對H/R損傷的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制與誘導(dǎo)具有保護(hù)作用的HO-1表達(dá)有關(guān)，為闡釋AS-Ⅳ抗心肌缺血再灌注損傷提供了理論依據(jù)。