吳 舜 ，陳明君 ，周 燕

（1．武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430400；2．武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，武漢 430400）

隨著對心臟疾病研究的不斷深入，心肌細胞能量代謝紊亂及凋亡的研究已成為當前熱點。心肌細胞能量代謝的主要場所在線粒體，而且細胞凋亡的起始也發(fā)生在該細胞器[1]。線粒體功能障礙會導致心力衰竭（心衰）的發(fā)生發(fā)展，因此改善線粒體功能是治療心衰的重要環(huán)節(jié)[2]。線粒體功能障礙及其動力學失衡是心肌肥厚發(fā)生的重要誘導因素[3]，因為線粒體在心肌細胞能量代謝、信號傳導、細胞增殖等方面發(fā)揮重要作用。槲皮黃酮是黃酮類活性物質(zhì)，表現(xiàn)出抗氧化、抗炎癥及參與免疫調(diào)節(jié)等方面的作用[4-5]。除此之外，槲皮黃酮還可以改善線粒體功能障礙、降低氧化應激損傷，具有保護心肌細胞免受損傷的作用[6]。本研究中采用血管緊張素II（AngII）誘導原代心肌細胞肥大，觀察槲皮黃酮對心肌細胞能量代謝紊亂的保護作用及其對線粒體功能障礙、穩(wěn)定線粒體動力學平衡的影響。

1 材料及方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠（1～3 d）購自北京維通利華實驗動物中心，許可證號SCXK（京）2006-0009。

1.2 主要試劑及儀器 槲皮黃酮（中國食品藥品檢定研究院，批號100357-201603），DMEM培養(yǎng)基、II型膠原酶、FBS（美國Gibco公司），胰蛋白酶（美國Hyclone公司），AngII（美國Sigma公司），CCK8試劑盒（Ameresc公司），BCA試劑盒（上海碧云天公司），三磷酸腺苷（ATP）試劑盒、JC-1試劑盒（英國Abcam公司），兔抗鼠視神經(jīng)萎縮蛋白（OPA1）、動力相關(guān)蛋白 1（Drp1）、磷酸化動力相關(guān)蛋白（p-Drp1）及 βactin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，HRP標記羊抗兔IgG抗體（武漢谷歌生物公司）。Victor3 1420 Multilable Counter酶標儀（DX540，美國），DYCZ-24DN型電泳儀（北京六一儀器廠，中國），4000B倒置相差顯微鏡及成像系統(tǒng)（Leica，德國），HERA cell CO2細胞培養(yǎng)箱（Heraeus，德國），自動X光片機UPV凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc-It/EC3）。

1.3 原代心肌細胞的培養(yǎng)和鑒定 原代心肌細胞分離、培養(yǎng)和鑒定參考文獻[7]，將心肌組織消化為單細胞懸液后，差速離心分離加入含20%FBS及0．1mmol/L5-溴脫氧尿嘧啶的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。待細胞生長至第4天進行心肌細胞鑒定，采用SABC法，細胞首先用大鼠α-橫紋肌動蛋白抗體孵育，DAB顯色后，陽性為α-心肌肌動蛋白。

1.4 藥物干預濃度篩選 參照多篇研究文獻，初步確定 AngII濃度分別為 1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L，槲皮黃酮濃度為 5、10、20 μmol/L，分別處理心肌細胞48、72 h后采用BCA試劑盒檢測蛋白總含量，采用CCK8試劑盒分析藥物對細胞的毒性，每組實驗做4個復孔，重復實驗6次。將確定的最佳藥物濃度用于后續(xù)研究。

1.5 心肌細胞蛋白濃度及細胞直徑測定 使用1×10-5mol/L濃度AngII和10 μmol/L槲皮黃酮干預心肌細胞48、72 h后，采用倒置顯微鏡觀察、拍照及測量細胞直徑，并采用BCA試劑盒檢測蛋白總含量，每次設(shè)3個復孔，重復實驗6次。

1.6 ATP含量測定 將6孔板細胞用AngII、槲皮黃酮干預 72 h 后裂解細胞，4 ℃ 、1．2×104r/min 離心12 min取上清。在96孔板中加入100 μL ATP檢測工作液，室溫放置5 min。再加入50 μL樣品或標準品，迅速混勻。采用酶標儀測定RLU值。

1.7 活性氧（ROS）水平測定 細胞經(jīng)藥物干預72 h后，采用10 μmol/L DCFH-DA溶液重懸，37℃細胞繼續(xù)培養(yǎng)20 min。每3～5 min顛倒一下，讓探針與細胞充分接觸。用培養(yǎng)基洗滌細胞3次，最后用200 μL磷酸緩沖鹽（PBS）溶液重懸，采用熒光酶標儀測定。其中激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

1.8 線粒體膜電位（MMP）測定 具體操作步驟參照試劑盒說明書進行熒光法測定。熒光顯微鏡濾波器激發(fā)波長為490 nm，散發(fā)波長為590 nm，可見亮紅色熒光；激發(fā)波長為490 nm，散發(fā)波長為530 nm，可見綠色熒光。

1.9 蛋白表達測定 藥物干預細胞后，收集細胞裂解，采用BCA法測定蛋白總濃度后，每孔上樣50 μg蛋白進行電泳、電轉(zhuǎn)、封閉，然后將條帶放入含OPA1、Drp1及p-Drp1的抗體溶液中（稀釋比 1∶1 000），4℃振搖過夜，次日用HRP標記二抗室溫反應1．5 h后，TBST洗膜3次后ECL顯色，進行蛋白表達分析。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SPSS 20．0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標準差s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊時采用LSD法，方法不齊時采用Dunnett’s T3法，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AngII濃度篩選 不同濃度AngII作用心肌細胞48、72 h后，CCK8法檢測細胞的吸光度OD值沒有明顯變化，說明AngII對心肌細胞沒有毒性作用。并且1×10-5mol/L濃度AngII對心肌細胞蛋白含量相對于空白組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；因此，1×10-5mol/L濃度AngII為本研究的有效干預劑量。見表1。

表1 不同濃度AngII對蛋白濃度的影響（Tab.1 Effects of varying concentrations of AngII on protein level（

表1 不同濃度AngII對蛋白濃度的影響（Tab.1 Effects of varying concentrations of AngII on protein level（

注：與空白組比較，*P＜0．05。

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2.2 槲皮黃酮濃度篩選 5、10、20 μmol/L槲皮黃酮與1×10-5mol/L濃度AngII共同作用心肌細胞48、72 h 后，10、20 μmol/L 槲皮黃酮可明顯降低心肌細胞中蛋白濃度，與模型組相比差異有顯著性（P＜0．05）；20 μmol/L 槲皮黃酮對心肌細胞具有明顯的毒性作用，10 μmol/L槲皮黃酮對心肌細胞沒有明顯的毒性作用，因此，選用10 μmol/L槲皮黃酮、1×10-5mol/L AngII進行后續(xù)實驗。見表2。

表2 不同濃度槲皮黃酮對蛋白濃度的影響Tab.2 Effects of varying concentrations of quercetin on protein level

表2 不同濃度槲皮黃酮對蛋白濃度的影響Tab.2 Effects of varying concentrations of quercetin on protein level

注：與空白組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05。

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2.3 槲皮黃酮對心肌細胞肥大的影響 與空白組比較，在48、72 h兩個時間點模型組心肌細胞總蛋白濃度顯著升高（P＜0．05），心肌細胞直徑明顯增大（P＜0．05），提示心肌細胞肥大模型構(gòu)建成功。在上述時點槲皮黃酮組心肌細胞中蛋白濃度均顯著降低（P ＜0．05），而細胞直徑只在 72 h時顯著減小（P＜0．05），48 h時細胞直徑也有減小，但與模型組比較沒有統(tǒng)計學差異（P ＞0．05）。見表 3。

2.4 槲皮黃酮對心肌細胞中ATP、ROS及MMP的影響 實驗檢測了72 h時間點槲皮黃酮對心肌細胞中ATP、ROS及MMP的影響，見表4。模型組中ATP水平和線粒體膜電位MMP相對空白組明顯降低（P＜0．05），ROS 含量明顯增高（P ＜0．05）；槲皮黃酮處理心肌細胞72 h后，ATP水平和線粒體膜電位MMP明顯升高，ROS含量明顯降低（P ＜0．05）。見表 4。

表3 槲皮黃酮對心肌細胞總蛋白含量及細胞直徑的影響Tab.3 Effects of quercetin on total protein content and cell diameter of cardiocytes

表3 槲皮黃酮對心肌細胞總蛋白含量及細胞直徑的影響Tab.3 Effects of quercetin on total protein content and cell diameter of cardiocytes

注：與空白組比較，*P ＜0．05；與模型組比較，#P ＜0．05。

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表4 槲皮黃酮對心肌細胞中ATP、ROS及MMP的影響Tab.4 Effects of quercetin on ATP,ROS and MMP in cardiocytes

表4 槲皮黃酮對心肌細胞中ATP、ROS及MMP的影響Tab.4 Effects of quercetin on ATP,ROS and MMP in cardiocytes

注：與空白組比較，*P ＜0．05；與模型組比較，#P ＜0．05。

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2.5 槲皮黃酮對心肌細胞中OPA1、Drp1及p-Drp1蛋白表達的影響 實驗檢測了72 h時間點槲皮黃酮對心肌細胞中OPA1、Drp1及p-Drp1蛋白表達的影響，見圖1。模型組中OPA1蛋白表達量顯著降低，而p-Drp1蛋白表達量顯著升高，與空白組比較差異有統(tǒng)計學差異（P＜0．05）；槲皮黃酮處理心肌細胞72 h后，OPA1蛋白表達量顯著增高，而p-Drp1蛋白表達量顯著降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0．05）。

3 討論

ROS是機體多個器官組織都存在的信號刺激子，ROS的堆積能導致心肌細胞氧化損傷，甚至引發(fā)細胞凋亡，然而線粒體是ROS產(chǎn)生的主要細胞器，線粒體功能狀態(tài)對保證細胞機能是否正常起著關(guān)鍵作用[8]。心肌肥厚的發(fā)病機制并未完全得以解釋，而學者提出其與線粒體的功能密切相關(guān)，因為能量代謝紊亂、氧化損傷及線粒體膜電位MMP降低都會引起心肌細胞肥厚。AngII屬于腎素血管緊張素系統(tǒng)的關(guān)鍵分子，它能夠介導心肌細胞ROS過多產(chǎn)生，從而誘導心肌細胞肥大及凋亡[9]。AngII能夠作用于NADPH氧化酶途徑誘導心肌細胞ROS的產(chǎn)生進而促使蛋白質(zhì)合成。AngII不直接引起心肌能量代謝障礙，而是誘導ROS大量產(chǎn)生，導致心肌肥大及線粒體結(jié)構(gòu)、功能損傷。筆者采用1×10-5mol/L濃度AngII作用于心肌細胞48、72 h后，心肌細胞總蛋白濃度明顯升高、細胞直徑明顯增大，說明AngII可以很好地構(gòu)建心肌細胞肥大模型。然而經(jīng)過10 μmol/L槲皮黃酮能夠改善心肌細胞肥大，表現(xiàn)在減少了細胞總蛋白濃度及細胞大小。AngII刺激心肌細胞時，會導致線粒體功能損傷，ATP生成減少，AngII持續(xù)的刺激會導致線粒體ROS過度產(chǎn)生，后者進而損傷氧化-還原的動態(tài)平衡，進一步引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，導致膜內(nèi)外離子分布紊亂，引起線粒體膜電位MMP降低[10]。本研究發(fā)現(xiàn)1×10-5mol/L 濃度 AngII作用心肌細胞48、72h后，心肌細胞內(nèi)ATP水平及MMP顯著降低，并且ROS含量顯著升高，進一步論證了前期報道結(jié)果。然而經(jīng)過槲皮黃酮處理心肌細胞72 h后，細胞內(nèi)ATP水平及MMP顯著升高，而且ROS含量顯著降低，說明槲皮黃酮可通過抑制ROS的產(chǎn)生從而改善線粒體的能量代謝。

圖1 槲皮黃酮對心肌細胞中OPA1、Drp1及p-Drp1蛋白表達的影響s，n=6）Fig.1 Effects of quercetin on expressions of OPA1,Drp1 and p-Drp1 in cardiocytess，n=6）

線粒體的融合-分裂由動力蛋白相關(guān)的GTP蛋白酶精細調(diào)控，包括線粒體融合相關(guān)蛋白（Mfn）、線粒體分裂相關(guān)蛋白Drp1和線粒體分裂蛋白1，而Drp1在心肌細胞能量代謝及線粒體自噬中起著關(guān)鍵作用[11]。Drp1蛋白磷酸化可使該蛋白轉(zhuǎn)運到線粒體膜外，引起線粒體降解，導致心肌細胞氧化磷酸化水平降低，ATP合成異常，MMP下降，進而誘導心肌細胞肥大[12]。本研究中AngII能誘導OPA1表達降低，Drp1蛋白磷酸化水平升高，進而引起線粒體片段化，然而槲皮黃酮能夠改變上述蛋白表達的水平，進而改善心肌細胞的肥大?？傊?，槲皮黃酮對AngII引起的心肌細胞肥大具有保護作用，其作用機制可能與降低心肌細胞線粒體功能障礙、穩(wěn)定線粒體動力學平衡相關(guān)。