沈俊逸，趙智明，劉春麗，壯雨雯，徐文俊，蔡 輝

（中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，南京 210002）

糖尿病并發(fā)腦梗死是多因素、多途徑、多方式共同作用的結(jié)果[1-2]。近年來，多項研究顯示在糖尿病腦梗死的缺血區(qū)可以觀察到血管新生現(xiàn)象，以毛細(xì)血管密度增高、微血管形成和側(cè)枝循環(huán)建立為主要表現(xiàn)，這些新生血管有助于神經(jīng)缺損功能的修復(fù)[3]。糖尿病腦梗死后，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）和CXC趨化因子受體4（CXCR4）下調(diào)，造成內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）的數(shù)量減少，黏附、遷移功能的下降，復(fù)元醒腦湯能夠有效地促進(jìn)缺血腦組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，同時增強(qiáng)了EPCs增殖、黏附和遷移的功能[4]。阻斷SDF-1/CXCR4軸信號通路后，梗死組織還有部分血管新生，說明可能有其他機(jī)制參與了糖尿病腦梗死后的血管新生。Wang等[5]研究結(jié)果顯示在糖尿病大鼠中微小RNA-320（miRNA-320）的表達(dá)升高。將miRNA-320的類似物轉(zhuǎn)染至糖尿病心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，細(xì)胞的增殖和遷移就會受到抑制；如果轉(zhuǎn)染miRNA-320的抑制劑則會出現(xiàn)相反的結(jié)果，細(xì)胞的增殖和遷移能力增強(qiáng)，胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)了血管新生[6-8]。miRNA-320負(fù)性調(diào)控IGF-1及其胰島素樣生長因子-1受體（IGF-1R），對糖尿病誘發(fā)的血管病變有重要影響[9-11]。因此，課題組推測復(fù)元醒腦湯對糖尿病腦梗死的作用機(jī)制可能與miRNA-320基因表達(dá)調(diào)控因子促進(jìn)缺血腦組織的血運(yùn)重建有著重要聯(lián)系。本研究以腦皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMECs）為研究對象，觀察miRNA-320基因表達(dá)及其基因沉默后的變化，以及復(fù)元醒腦湯對其干預(yù)前后的變化，以期闡述復(fù)元醒腦湯促進(jìn)糖尿病腦梗死缺血腦組織區(qū)域血運(yùn)重建的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料

1.1.1 實驗動物 20只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（250±25）g，購自上海SLAC實驗動物有限公司[動物合格證：SCXK（滬）2011-009]。

1.1.2 實驗藥物 復(fù)元醒腦湯[人參10 g（單煎），三七 10 g，石菖蒲 12 g，水蛭 10 g，益母草 30 g，生天南星 15 g，制大黃 9 g（后下），濃度 388 g/L]由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院藥劑科制備。

1.1.3 主要試劑及儀器 胎牛血清（FBS），青霉素和鏈霉素溶液（P/S）和DMEM/F12培養(yǎng)基購買于法國Biosera公司；血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（ECM）購買于美國ScienCell公司；RNA抽提試劑，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR green實時熒光定量PCR試劑盒購自日本 Takara 公司；MiR control inhibitor，LipofectamineTMRNAi MAX Transfection Reagent、rno-miRNA-320 inhibitor購買于Thermo公司；鏈脲佐菌素（STZ）、MTS、結(jié)晶紫 和Ⅱ型膠原酶（Type2 Collagenase）購買于美國Sigma公司，Ⅷ因子相關(guān)抗原（vwF）抗體購于美國Abcam公司；基質(zhì)膠Matrigel購買于美國Gibco公司。酶標(biāo)儀（美國Thermo公司，Multiskan MK3型），實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司，CFX 96型），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本三洋，MCO-18AC）。

1.2 BMECs的分離 根據(jù)文獻(xiàn)[12]復(fù)制糖尿病腦梗死大鼠模型，注射STZ制備糖尿病大鼠模型，線栓法制備腦梗死模型，依照Berderson評分（≥1）[13]確定造模成功。成模后，用10%的水合氯醛（1 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，再脫頸處死大鼠。用75%乙醇消毒大鼠，迅速斷頭取出完整的腦組織，放到預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中進(jìn)行漂洗，將大腦皮質(zhì)組織剪成1 mm3的小塊，放入1 mL DMEM/F12培養(yǎng)液。離心收集組織，將組織加入到0．1%的Ⅱ型膠原酶，于37℃水浴消化40 min，離心8 min（1 000 r/min），去除上清，加入20%FBS懸浮中和，離心（1 000 r/min）20 min，去除神經(jīng)和血管組織，收集沉淀。繼續(xù)將2 mL的Ⅱ型膠原酶懸浮沉淀，于37℃進(jìn)行水浴消化，離心 8 min（1 000 r/min），去上清后用 20%FBS混勻，進(jìn)行離心（1 000 r/min）20 min，底部沉淀為微紅色的微血管段。

1.3 BMECs的培養(yǎng)和鑒定 用ECM培養(yǎng)基（ECM+10%FBS+1%P/S）混懸細(xì)胞，接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)過夜，于倒置顯微鏡下拍照記錄細(xì)胞形態(tài)。將2×105細(xì)胞接種到24孔板，培養(yǎng)3 d，用PBS漂洗細(xì)胞，加入4%的多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，37℃用抗體 vwF 孵育細(xì)胞（1∶200）30 min，用 PBST 漂洗細(xì)胞3次，用細(xì)胞核染料DPAI染細(xì)胞核，并在倒置熒光顯微鏡下拍照。

1.4 對照血清和含藥血清的制備 取健康雄性SD大鼠20只，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為2組，每組10只，SPF級飼養(yǎng)。一組常規(guī)飼養(yǎng)，另一組常規(guī)飼養(yǎng)的基礎(chǔ)上以復(fù)元醒腦湯灌胃，根據(jù)臨床經(jīng)驗每日2次按10．4 g/kg體質(zhì)量給以復(fù)元醒腦湯灌胃（參照陳奇主編《中藥藥理實驗方法學(xué)》依實驗動物與人體表面積比計算），連續(xù)3 d。于末次給藥1 h后腹主動脈采血，制備對照血清和含藥血清。腹主動脈采血后，血樣室溫放置1 h，離心，無菌分離并混合血清，56℃水浴中滅活補(bǔ)體30 min，-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 BMECs轉(zhuǎn)染miRNAinhibitor 當(dāng)培養(yǎng)的BMECs達(dá)到60%～80%貼壁后，以3×105個/孔鋪于6孔板，一半給予對照血清（5%）處理，一半給予含藥血清（5%）處理，培養(yǎng)24 h后用Lipofect RNAi MAX試劑盒分別轉(zhuǎn)染 miRNA inhibitor control、rno-miRNA-320inhibitor40pmol。共分為4個實驗組：對照血清+control inhibitor組，對照血清+miRNA-320inhibitor組，含藥血清+controlinhibitor組，含藥血清+miRNA-320 inhibitor組。

1.6 BMECs細(xì)胞的增殖能力測定 miRNA轉(zhuǎn)染24h后的BMECs細(xì)胞，用胰酶消化離心（1000r/min，5 min）收集細(xì)胞，接種入 96孔板（3×103/孔）。于第1、2、3、4、5 天用甲臜化合物（MTS）檢測細(xì)胞活性：每孔中加入 20 μL MTS，37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h后，用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度值。

1.7 BMECs細(xì)胞的遷移能力測定 miRNA-320轉(zhuǎn)染BMECs 24 h后，用胰酶消化細(xì)胞，將1×106個細(xì)胞接種到24孔的Transwell小室的上室中（孔徑8 μm），在下室中加入 500 μL 的 ECM 培養(yǎng)基（含有空白大鼠血清和中藥大鼠血清）。24 h后，將上室取出，用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞，用0．1%的結(jié)晶紫染色，小室的上室用棉簽擦拭干凈，在倒置顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞遷移。拍照結(jié)束后用10%的醋酸洗脫結(jié)晶紫，將洗脫后的液體收集在酶標(biāo)儀下檢測吸光值（560 nm）。

1.8 BMECs細(xì)胞的小管形成能力測定 將100 μL Matrigel均勻涂抹到24孔板中，37℃放置30 min，待凝固，加入 500 μL 的細(xì)胞懸液（1×106），然后24孔板放置到37℃、5%CO2培養(yǎng)箱12 h，拍照觀察成管能力。

1.9 BMECs miRNA-320、IGF-1 和 IGF-1R mRNA基因表達(dá)水平檢測 BMECs細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNAinhibitor control和rno-miRNA-320 inhibitor，并分別用空白血清和中藥血清處理培養(yǎng)48 h后，收集的BMECs細(xì)胞樣本，抽提RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實時熒光定量 PCR（qPCR）檢測 miRNA-320、IGF-1、IGF-1 R的基因表達(dá)，以U6作為miRNA內(nèi)參，GAPDH作為mRNA內(nèi)參。引物序列如下：MiR-320-F ACACTCCAGCTGGGACTTAAACGTGGTTGTAC；MiR-320-R TGTCGTGGAGTCG GCAATTC；U6-F GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT；U6-RCGCTTCAC GAATTTGCGTGTCAT；IGF-1-F ACTCGATAACTTTGCCAGAAGAG；IGF-1-RTTCTTGTGTGTCGATAGGGGC；IGFR-F TAGTGGGT GTGTTGCCACC；IGFRR TCCACCGTGTTGCAAGA CTAG；GAPDH-F ACTTTGGCATCGTGGAAGGG；GAPDH-R TGCAGGGATGATGTTCTGGG。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 BMECs的鑒定 白光下分離培養(yǎng)的BMECs細(xì)胞形態(tài)呈短梭形，見圖1A。Ⅷ因子為BMECs的標(biāo)志性蛋白，DAPI為核酸染料用于指示細(xì)胞核，見圖1B，用免疫熒光的方法檢測BMECs發(fā)現(xiàn)細(xì)胞漿及細(xì)胞核周圍具有綠色熒光，見圖1C，免疫熒光（vwF）鑒定結(jié)果顯示分離的細(xì)胞為陽性的BMECs，而且純度高，見圖1D。

圖1 分離培養(yǎng)的BMECs細(xì)胞形態(tài)和Ⅷ因子免疫熒光Fig.1 BMECs morphology and factorⅧimmunofluorescence

2.2 miRNA-320 inhibitor顯著抑制miRNA-320的表達(dá) BMECs轉(zhuǎn)染miRNA inhibitor control和rnomiRNA-320 inhibitor 48 h后，收取細(xì)胞，抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄，做qPCR檢測miRNA-320的表達(dá)，用U6作為內(nèi)參，驗證miRNA inhibitor的效率。結(jié)果顯示miRNA-320 inhibitor的相對基因表達(dá)量 （0．19±0．03）可以顯著抑制miRNA-320的相對基因表達(dá)（miRNA control為 1．02±0．14，P＜0．01）。抑制效果可以達(dá)到80%以上。

2.3 BMECs細(xì)胞的增殖能力 BMECs細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA control inhibitor和rno-miRNA-320 inhibitor 24 h 后，于第 1、2、3、4、5 天分別用 MTS 法做細(xì)胞增殖實驗。如圖2所示，與對照血清+control inhibitor組相比，對照血清+miRNA-320 inhibitor組、含藥血清+control inhibitor組、含藥血清+miRNA-320 inhibitor組 BMECs的細(xì)胞增殖能力都顯著增強(qiáng)（P＜0．01）。從培養(yǎng)的第2天開始，BMECs的細(xì)胞增殖能力出現(xiàn)顯著差異，可見含藥血清和miRNA-320抑制劑都可以促進(jìn)BMECs的細(xì)胞增殖，從培養(yǎng)的第3天開始，中藥血清促進(jìn)BMECs增殖能力與miRNA-320抑制劑相當(dāng)，在含藥血清和miRNA-320抑制劑的雙重作用下，BMECs的增殖最為明顯。

圖2 各組BMECs細(xì)胞的增殖能力Fig.2 Proliferative capacity of BMECs cells in each group

2.4 BMECs細(xì)胞的遷移能力 見圖3和表1。與對照血清+control inhibitor組相比，對照血清+miRNA-320 inhibitor組、含藥血清+control組和含藥血清+miRNA-320 inhibitor BMECs的細(xì)胞遷移能力具有顯著差異（P＜0．01），可見含藥血清和抑制 miRNA-320都可以促進(jìn)BMECs的細(xì)胞遷移，miRNA-320抑制劑促進(jìn)BMECs遷移的能力與中藥血清相類似，沒有統(tǒng)計學(xué)差異，在中藥血清和miRNA-320抑制劑的雙重作用下，BMECs的遷移能力增加更明顯。

2.5 BMECs細(xì)胞的小管形成能力 取處于對數(shù)生長期的BMECs細(xì)胞進(jìn)行小管形成能力的測定。對照血清+control inhibitor組的成管能力最弱。含藥血清和miRNA-320 inhibitor對成管都有一定的促進(jìn)作用，但含藥血清+miRNA-320 inhibitor組促進(jìn)成管能力最強(qiáng)。見圖4。說明復(fù)元醒腦湯和miRNA-320抑制劑均可以通過促進(jìn)小管形成修復(fù)糖尿病腦梗死的血管損傷。

圖3 含藥血清對BMEC遷移能力的影響（×200）Fig.3 Effect of serum containing traditional Chinese medicine on the BMEC mobility（×200）

表1 酶標(biāo)儀檢測含藥血清對BMEC遷移能力的影響Tab.1 The effect of serum containing traditional Chinese medicine on the migration of BMEC was detected by enzyme labeling apparatus

圖4 各組BMECs細(xì)胞的成管能力（×40）Fig.4 Tube forming ability of BMECs cells in each group（×40）

2.6 各組BMECs miRNA-320、IGF-1、IGF-1R基因表達(dá)水平 如表2所示，與對照血清+control inhibitor組比較，對照血清+miRNA-320 inhibitor組、含藥血清+control inhibitor組和含藥血清+miRNA-320 inhibitor組的miRNA-320和IGF-1的基因表達(dá)水平均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．01）?？梢姾幯搴鸵种苖iRNA-320都可以抑制miRNA-320的基因表達(dá)，并促進(jìn)IGF-1的基因表達(dá)，其中miRNA-320抑制劑的作用強(qiáng)于含藥血清。各組IGF-1R 基因的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。

表2 各組BMECs miRNA-320、IGF-1、IGF-1R基因表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of microRNA-320,IGF-1 and IGFR of BMECs in each group

3 討論

糖尿病腦梗死發(fā)生后miRNA-320的表達(dá)升高，miRNA-320作為IGF-1的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，會降低IGF-1的表達(dá)[14-16]。腦缺血發(fā)生后，IGF-1及IGF-1R持續(xù)內(nèi)源性消耗，合成減少，IGF-1及其IGF-1R表達(dá)下降，血管新生能力受到抑制。同時由于缺血神經(jīng)組織處于缺氧狀態(tài)，會誘發(fā)神經(jīng)組織的凋亡和壞死，IGF-1作為一種神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)神經(jīng)再生因子，可以促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，同時可以降低神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，而IGF-1的缺乏會使神經(jīng)組織失去自我保護(hù)和修復(fù)的能力[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)元醒腦湯可以促進(jìn)BMECs的增殖、遷移及成管能力。BMECS的數(shù)量增加和功能增強(qiáng)一方面為腦部神經(jīng)組織提供了大量的氧氣和營養(yǎng)的供應(yīng)，同時改善了梗死腦組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞與神經(jīng)元的損害，促進(jìn)血運(yùn)重建，有助于神經(jīng)缺損功能的恢復(fù)。

復(fù)元醒腦湯能夠發(fā)揮良好作用主要是因為其方劑配伍符合中醫(yī)的診治思想。中醫(yī)認(rèn)為糖尿病屬于“消渴”，腦梗死為“中風(fēng)”?！跋省币栽餆釣闃?biāo)，“中風(fēng)”是經(jīng)絡(luò)瘀血、肝臟和腎臟陰虛以及氣血阻滯造成。治療糖尿病腦梗死要堅持扶正元?dú)?，化痰祛瘀、息風(fēng)泄熱、醒腦開竅[19-20]。復(fù)元醒腦湯方劑由人參、生天南星、石菖蒲、三七、水蛭、益母草、大黃組成，有很好的臨床療效。人參為君補(bǔ)元?dú)猓皇牌押蜕炷闲堑淖饔檬腔硖禐a濁開竅，水蛭、三七和益母草用于活血化瘀；大黃具有息風(fēng)泄熱功效。本研究從miRNA-320負(fù)性調(diào)控IGF-1的表達(dá)方向?qū)?fù)元醒腦湯促進(jìn)糖尿病腦梗死缺血腦組織血運(yùn)重建的分子機(jī)制和作用靶點(diǎn)進(jìn)行了深入探索，豐富和發(fā)展了復(fù)元醒腦湯的作用機(jī)制。