樊 超 王 洋 楊 晴 許曉東 楊曉宇 司軍強 安慧霞 高松寶

（1鄭州市骨科醫(yī)院麻醉科，鄭州450052；2石河子大學醫(yī)學院新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，石河子832002；3河南大學淮河醫(yī)院麻醉科，開封475000；4河南省人民醫(yī)院麻醉科，鄭州450003；5鄭州大學第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，鄭州450052）

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain, NP)屬于一種慢性疼痛，由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或病變而直接造成，常表現(xiàn)出自發(fā)性疼痛、痛覺過敏、異常疼痛等臨床特征。發(fā)病率較高，發(fā)生機制較為復雜、治療周期長、效果差。因此，神經(jīng)病理性疼痛已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)神經(jīng)科學研究的一個重要難題。目前臨床上主要應用阿片類藥物來緩解疼痛，但其并不能完全逆轉(zhuǎn)或終止NP的發(fā)作。動物研究[1]發(fā)現(xiàn)右美托咪定聯(lián)合阿片類藥物鞘內(nèi)給藥可有效緩解疼痛，并能夠減少阿片類藥物的用量，降低不良反應的發(fā)生。臨床研究[2]也證實局部注射右美托咪定可以有效緩解疼痛的發(fā)生和減少阿片類藥物的應用，提高鎮(zhèn)痛的質(zhì)量。另外，右美托咪定聯(lián)合局麻藥物鞘內(nèi)給藥不僅能夠延長局麻藥物作用時間，而且可以降低不良反應的發(fā)生率[3]。因此，右美托咪定在鎮(zhèn)痛領(lǐng)域具有廣闊的應用前景。

右美托咪定作為一種高度選擇性的α2腎上腺能受體激動劑，α2腎上腺能受體激動后通過不同信號通路產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抑制交感神經(jīng)活動等不同效應[4]。脊髓是右美托咪定產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用的主要部位，但其在脊髓水平產(chǎn)生鎮(zhèn)痛的機制尚不完全明確。研究表明突觸前抑制參與了疼痛的調(diào)節(jié)作用[5]，γ-氨基丁酸(GABA)是脊髓中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在脊髓背角，GABAA受體通過突觸前抑制作用，減少初級傳入神經(jīng)末梢興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，即“突觸前抑制”來參與神經(jīng)病理性痛的發(fā)生[6]。而背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)細胞膜上存在大量GABAA受體，在緩解疼痛的作用中起著關(guān)鍵作用[7,8]。那么，右美托咪定是否通過參與神經(jīng)病理性疼痛大鼠DRG神經(jīng)元上GABAA受體功能的調(diào)節(jié)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，尚未可知。因此，本研究通過建立大鼠坐骨神經(jīng)壓迫性損傷模型(chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI)，經(jīng)鞘內(nèi)注射右美托咪定，通過測試熱縮足潛伏期變化，應用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄右美托咪定對CCI模型大鼠DRG神經(jīng)元GABAA受體介導的膜電流的影響，進一步探討鞘內(nèi)注射右美托咪定對神經(jīng)病理性疼痛的作用及其機制。

方 法

1.主要材料和儀器

實驗所用動物由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供且通過動物倫理學審批的6周齡SD大鼠(180～220 g)，雄性大鼠，動物質(zhì)量符合一級標準。葡萄糖酸鉀、膠原酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑、荷包牡丹堿(bicuculline)、GABA、HEPES為Sigma公司產(chǎn)品，右美托咪定注射液（200 μg: 2 ml，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）。其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。Axon 700B放大器（美國MD公司）、P-97拉制儀（美國Sutter公司）、生物電信號記錄計算機（Axoscope 10.2 軟件，美國MD公司）。

2.大鼠鞘內(nèi)置管方法

雄性SD大鼠，體重180～220 g，鞘內(nèi)置管參照文獻[9]并加以改進，大鼠經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉(35～38 mg/kg)麻醉后，以髂棘(L6)為中點，沿背部正中間縱向切開皮膚（約1.5 cm），測量進針處（L5-L6間隙，平髂棘，與末肋的距離約為3～3.5 cm），沿L5-L6棘突正中間垂直插入導針，進入蛛網(wǎng)膜下腔時有明顯的突破感，然后將導針頭端向大鼠頭端傾斜，自導針置入Microspinal導管3～3.5 cm即可到達腰膨大部分，此過程中可見后肢抽動。拔出導針，在皮下從切口處向頭端造一隧道，將導管沿隧道放入皮下，前端從頸后方穿出，通過縫合線固定于皮膚，其前端保留4 cm。熱熔封閉管的外端口，以防腦脊液外溢。給藥時，剪去熔封的末端，30 μl的微量進樣器針頭直接插入Microspinal導管內(nèi)給藥。給藥速度均勻且緩慢，約15 s，給藥后再熔封管口。大鼠清醒后24 h觀察其活動情況，剔除出現(xiàn)運動功能障礙的大鼠。大鼠鞘內(nèi)注射2%利多卡因20 μl，出現(xiàn)雙后肢麻痹現(xiàn)象認為導管位置正確，剔除注藥30 min內(nèi)未出現(xiàn)雙后肢麻痹大鼠。觀察5天，對未出現(xiàn)運動障礙和體重明顯下降的大鼠進行實驗分組及建模。

3.CCI模型制備

鞘內(nèi)置管成功的雄性SD大鼠36只體重180～220 g。隨機12只作為CCI組、12只制備S組、12只作為D組。CCI模型制備參照文獻[10]，大鼠經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉(35～38 mg/kg)麻醉，備皮后嚴格遵循無菌原則進行手術(shù)。在股骨外側(cè)縱向切開皮膚，鈍性分離肌肉，充分暴露坐骨神經(jīng)，在坐骨神經(jīng)三叉分支的近端約5 mm 處，采用鉻腸線做4道結(jié)扎間距為1 mm，結(jié)扎的松緊度以不影響神經(jīng)外膜的血運為宜，然后逐層縫合。S組除不做鉻腸線結(jié)扎外其余方法同上。D組結(jié)扎坐骨神經(jīng)后即刻至犧牲每天鞘內(nèi)注射右美托咪定2 μg/kg，生理鹽水稀釋至10 μl，1次/日，持續(xù)14天。S組和CCI組以等量生理鹽水替代。各組均加強營養(yǎng)并且單獨飼養(yǎng)，嚴格12 h明暗交替光照。

4.熱縮足潛伏期實驗

術(shù)前1 d記為T0，術(shù)后3、5、7、10、14 d分別 記 為 T1、T2、T3、T4、T5。 分 別 在 T0、T1、T2、T3、T4、T5給藥30 min后，對CCI組、S 組和D組大鼠進行TWL測試，采用熱刺痛儀DB020（北京智鼠多寶生物科技有限責任公司），將大鼠置于3 mm厚的玻璃板上，熱輻射照射到術(shù)側(cè)下肢足底中部，記錄從光源照射到出現(xiàn)縮足反應的時間，即為熱痛閾，每只測試3次，每次間隔8 min，取其平均值，每次測試時間為上午9～11點。

5.全細胞膜片鉗記錄

參考文獻[11]將S組、D組和CCI組（術(shù)后14 d）大鼠擊昏、斷頭后迅速切開背部皮膚沿脊柱兩側(cè)剪斷與之相連的肋骨, 取出手術(shù)側(cè)L4-L6段DRG置于O2飽和的細胞外液中，外液成分(mmol/L)：NaCl 150；KCl 5；CaCl22.5；MgCl21；HEPES 10；D-glucose 10，Ph = 7.4 溶液滲透壓為330 mOsm。在顯微鏡下用角膜剪及游絲鑷剪除相連的神經(jīng)和結(jié)締組織，將分離出的DRG剪碎轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿內(nèi)，加胰蛋白酶0.25 mg/ml，膠原酶0.5 mg/ml后移于試管中，在37 ℃恒溫箱中孵育15 min。然后加入適量胰蛋白酶抑制劑 (soya bean trypsin inhibitor, typeⅡ2s) 終止胰蛋白酶的消化。將上述機械分離和酶處理的DRG神經(jīng)元離心(800 r/min, 6 min)，然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿內(nèi)，室溫(22～30 ℃)下靜置40 min。

選擇貼壁良好、輪廓及形態(tài)清晰、胞膜完整有光暈折光性強且胞質(zhì)均勻的中小神經(jīng)元。使用Axon700B放大器（美國MD公司）進行實驗記錄，玻璃微電極用P-97拉制儀（美國Sutter公司）拉制，電極阻抗約為1～5 MΩ，玻璃微電極所充內(nèi)液成分為 (mmol/L)：KCl 140；CaCl21；MgCl22；HEPES 10；EGTA 11，在電極與細胞膜形成高阻(1～5 GΩ)封接后將膜吸破，然后調(diào)節(jié)電容和串聯(lián)電阻補償保持電壓為負60 mV。膜電流應用低通濾波(10 Hz)[11]。GABA采用無糖外液配制成0.1、1.0、10.0、100.0、1000.0 μmol/L。參考文獻[12]給藥系通過微操縱器移動快速換液裝置的排藥管進行，排藥管的每個管口的直徑0.5 mm, 在全細胞模式記錄下，開放裝有GABA的排藥管，快速移至所檢測細胞同一平面，管口距所記錄的細胞約100 μm，在倒置顯微鏡下可見灌流的藥液完全覆蓋檢測細胞。GABA灌流5 s后移開加藥管口并關(guān)閉，記錄GABAA受體激活電流，將處于開放狀態(tài)的細胞外液管口移至檢測細胞洗脫5 min，然后灌流另一濃度的GABA，依次由低濃度到高濃度灌注。灌流GABA100 μmol/L 5 s，記錄到IGABA，洗脫5 min后，預灌流GABAA受體選擇性拮抗劑荷包牡丹堿100 μmol/L 30 s時，灌流GABA100 μmol/L 5 s，未記錄到IGABA。則記錄到的GABA電流為GABAA受體激活電流。實驗在室溫22～30℃范圍進行。

6.統(tǒng)計學方法

所有計量數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差(±SD)，采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，多組比較采用單因素方差分析，成組數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

CCI組手術(shù)側(cè)下肢術(shù)后發(fā)生明顯行為學改變，不能負重，行走時跛行，下肢可出現(xiàn)踮腳、頻繁舔后足、回縮等現(xiàn)象（見圖1），與T0比較，CCI組和 D 組 T1、T2、T3、T4、T5時 TWL 縮短 (P＜ 0.05)；與 S組 比 較，CCI組 和 D 組 T1、T2、T3、T4、T5時TWL明顯縮短(P＜ 0.05)；與D組比較，CCI 組T1、T2、T3、T4、T5時 TWL 縮短 (P＜ 0.05)；三組DRG神經(jīng)細胞見圖2，在全細胞膜片鉗實驗中選擇細胞直徑15～40 μm，受測的119個細胞中有102個對外加GABA 85.7% (102/119)敏感，其中34個細胞是CCI組、32個細胞是S組、其中36個細胞是D組，且不同濃度的GABA (0.1～1 000 μmol/L)激活為濃度依賴性的內(nèi)向電流。此反應可被GABAA受體選擇性拮抗劑bicuculline (100 μmol/L)所阻斷（見圖3），提示GABA 激活的電流由GABAA受體所介導。

圖1 三組大鼠不同時間點熱縮足反射潛伏期隨時間變化(n = 12,±SD)Fig.1 The incubation latency of three groups of rats at different time points is different with time (n = 12,±SD)

圖2 三組DRG神經(jīng)細胞Fig.2 Three groups of DRG nerve cells

圖3 GABA-AR特異性拮抗劑bicuculline (100 μmol/L)對GABA激活膜電流的阻斷作用 (±SD)**P ＜ 0.01，與GABA激活電流比較Fig.3 GABA-AR specific antagonist bicuculline (100 mol/L)blocked GABA activated membrane current (±SD)**P ＜ 0.01, compared with GABA activated membrane current.

在CCI 組、S組、D組的DRG神經(jīng)元上GABA (0.1～1 000 μmol/L)引起的內(nèi)向電流具有濃度依賴性（見圖4），相同濃度的GABA在CCI 組激活的電流幅度均小于S組和D組(P＜ 0.05)，相同濃度的GABA在D組激活的電流幅度均小于S組(P＜ 0.05)。GABA (100 μmol/L)在 CCI組、D組和S組激活電流幅值分別為(452±78)、(827±173)、(1267±215) pA (n= 8～11)。

討 論

圖4 S組、D組、CCI術(shù)側(cè)組DRG神經(jīng)元GABA激活電流呈濃度依賴性(n = 8-11,±SD)(A)：示例圖；(B)：電流量效曲線注#P ＜ 0.05、*P ＜ 0.05、##P ＜ 0.001、**P ＜ 0.001，與S 組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.001，與 CCI組比較Fig.4 GABA activation currents of DRG neurons in Sgroup, D group and CCI side group were dose-dependently.current dose effect curves (n = 8-11,±SD)#P ＜ 0.05、*P ＜ 0.05、##P ＜ 0.001、 **P ＜ 0.001,compared with S group; #P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.001, compared with CCI group.

本研究參考文獻[13]選擇右美托咪定的實驗劑量。實驗中發(fā)現(xiàn)CCI組和D組在術(shù)后3、5、7、10、14 d時熱縮足反射潛伏期(Thermal withdrawal latency, TWL)降低，痛覺過敏，提示大鼠CCI模型制備成功。研究結(jié)果顯示，與S組比較，D組和CCI組在術(shù)后TWL縮短，與D組比較，CCI組術(shù)后TWL縮短，D組DRG神經(jīng)元上GABAA受體介導的膜電流大于CCI組。提示右美托咪定直接或間接增強了GABAA受體的功能，緩解了大鼠神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生，提示神經(jīng)病理性疼痛大鼠產(chǎn)生了痛覺的高敏性，而右美托咪定對疼痛起到一定的緩解作用。

本實驗中選擇了DRG神經(jīng)元進行全細胞膜片鉗研究，因為DRG神經(jīng)元是軀體感覺的初級傳入神經(jīng)元，在疼痛的發(fā)生和維持中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。它不僅是感覺沖動由外周向中樞傳導的通路，而且對傳入終末部位的初級感覺信息通過突觸前抑制作用進行調(diào)控。研究表明[14]DRG神經(jīng)元上主要的突觸前抑制性神經(jīng)遞質(zhì)是GABA，而GABA發(fā)揮突觸前抑制作用的主要功能是由GABAA受體所介導。本實驗中灌流GABA激活的內(nèi)向膜電流，可被GABAA受體選擇性拮抗劑bicuculline所阻斷，提示GABA激活的膜電流由GABAA受體所介導。GABAA受體屬于配體門控離子通道受體，由GABA識別位點、苯二氮卓受體識別位點、氯離子通道三部分組成，當GABA與其受體結(jié)合，引起與之相偶聯(lián)的Cl-通道開放，引起大量Cl-外流，產(chǎn)生突觸前抑制，使后傳入的感覺信息引起神經(jīng)末梢的動作電位減小，從而減少興奮性神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)末梢的釋放，致使脊髓背角二級感覺痛敏神經(jīng)元活動減少，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[15]。

本研究電生理結(jié)果表明，CCI組DRG神經(jīng)元上GABAA受體介導的膜電流小于S組(P＜ 0.05)，這一結(jié)果與本實驗室前期研究一致[16]。提示神經(jīng)病理性疼痛的損傷導致了相應的DRG神經(jīng)元上GABAA受體功能減弱，其機制可能是，在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展過程中導致突觸前膜GABAA受體表達的下調(diào)，或者是突觸前膜GABAA受體發(fā)生了磷酸化或脫磷酸化，使受體的功能活動降低[17]。GABAA受體功能的改變是介導神經(jīng)病理性疼痛的重要因素之一。Naik等[18]研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)病理性疼痛大鼠損傷DRG神經(jīng)元周圍給予GABAA受體的激動劑muscinol和gaboxadol，能產(chǎn)生濃度依賴性地緩解神經(jīng)病理性疼痛癥狀，而GABAA受體的拮抗劑bicuculline卻能加重神經(jīng)病理性痛的癥狀，提示GABAA受體參與了神經(jīng)病理性疼痛的傳遞和調(diào)節(jié)作用，與本研究結(jié)果相一致。

右美托咪定屬α2腎上腺能受體激動劑，α2受體是G蛋白偶聯(lián)受體，G蛋白偶聯(lián)受體介導一系列重要的生理應答及藥理學效應。激動后通過不同信號傳導通路產(chǎn)生不同效應。藍斑是右美托咪定主要鎮(zhèn)靜位點，脊髓是右美托咪定主要鎮(zhèn)痛部位，從而產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用，抑制交感神經(jīng)活動等效應。右美托咪定抑制腺苷酸環(huán)化酶活性和環(huán)磷腺苷合成，抑制鈣通道，激活超極化鉀通道，抑制鈣內(nèi)流至神經(jīng)末梢，抑制遞質(zhì)釋放[19]。本實驗結(jié)果表明：右美托咪定增強了GABAA受體的功能，我們推測可能是右美托咪定激動了G蛋白偶聯(lián)受體，介導了不同信號傳導通路的效應，激活了GABAA配體門控離子通道受體，降低Cl-通道開放的閾值，引起大量Cl-外流，產(chǎn)生突觸前抑制作用，可能是其產(chǎn)生脊髓水平的鎮(zhèn)痛機制之一。關(guān)于右美托咪定是如何在脊髓水平增強GABAA受體功能的機制，有待進一步探討研究。

綜上所述，右美托咪定可通過增強DRG神經(jīng)元上GABAA受體介導的膜電流，從而增強GABA介導的突觸前抑制作用，減輕大鼠神經(jīng)病理性疼痛。