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(青島理工大學 環(huán)境與市政工程學院，山東 青島 266033)

從開放實驗出發(fā)，作為課堂教學的有效補充，帶領學生探究海洋內生真菌的分離純化實驗操作[1]，既可以鍛煉學生微生物實驗技術中的無菌操作、菌種的分離純化過程，又可以通過發(fā)酵條件的優(yōu)化培養(yǎng)對海洋真菌的次級代謝產物進行初步的研究，使學生進一步了解環(huán)境微生物中真菌發(fā)酵條件的調控和次級代謝產物的應用-環(huán)境微生物資源化。本實驗對于海洋內生真菌的優(yōu)化培養(yǎng)衡量標準主要從真菌次級代謝產物的質量和抑菌活性兩個方面展開：真菌次級代謝產物的質量主要是分別對真菌培養(yǎng)液和菌絲體進行有機相萃取，然后蒸干稱重；抑菌活性有多種試驗方法[2-4]，本實驗主要是對4株細菌和5株農業(yè)病原真菌采用濾紙片擴散法[5-6]進行篩選研究。

1 實驗過程

1.1 實驗儀器

菌種分離與純化用：無菌操作箱，酒精燈，接種環(huán)，9cm平板，無菌棉，手術刀、鑷子、打孔器等。

菌種優(yōu)化培養(yǎng)用：旋轉蒸發(fā)儀，分液漏斗，分析天平等；所用試劑均為國產分析純試劑。

1.2 實驗試劑的配置

菌種分離與純化用PDA培養(yǎng)基[7]，消毒酒精(70%～75%的無水乙醇)

1.3 海洋內生真菌分離純化

樣品的采集與預處理：青島第二海水浴場附近的低潮間帶礁石上采集到一只鮑魚(圖1)。

圖1 青島海域鮑魚Fig.1 Abalone from Qingdao Coastline

菌種分離純化方法：主要采取組織分離法。先用無菌海水洗凈鮑魚表面，再用消毒酒精消毒30s左右，然后用無菌海水淋洗組織3～5次，最后用無菌吸水紙將生物表面的水吸干；接著將鮑魚放在無菌玻璃平板上，用無菌手術刀切開鮑魚組織，逐塊放在培養(yǎng)皿內，注意鮑魚組織切面與培養(yǎng)基接觸或直接插入培養(yǎng)基中，然后置于培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。待長出真菌菌落以后，使用劃線法[8]分離純化菌種。

1.4 海洋內生真菌優(yōu)化培養(yǎng)

使用4種不同的培養(yǎng)基[9](改良PDB、改良GPYM、MH1以及固體RICE培養(yǎng)基)對生長形貌奇特的A1菌株進行優(yōu)化培養(yǎng)，發(fā)酵體積每瓶約400mL。

1.5 粗提物的獲得

A1內生真菌靜置發(fā)酵14d和28d后，用乙酸乙酯滅菌，2d后發(fā)酵液用乙酸乙酯3次以上萃取，使用旋轉蒸發(fā)儀蒸干，獲得乙酸乙酯相浸膏；菌絲體晾干破碎后用80%丙酮-水萃取3次以上，旋蒸后得到丙酮相浸膏。稱重，即為A1內生真菌的次級代謝產物質量。

1.6 粗提物的抑菌活性

挑取適量A1菌株優(yōu)化培養(yǎng)各浸膏，以二甲亞砜配置成200 mg·mL-1的溶液，分別對4株細菌和5株農業(yè)病原真菌以濾紙片擴散法進行抑菌活性實驗[10]，每張濾紙片載樣量1mg。細菌、真菌陽性對照分別為氯霉素、兩性霉素B。

4株細菌中包括3株桿菌(枯草芽孢桿菌B.S.、蘇云金芽孢桿菌B.T.、大腸埃希氏桿菌E.C.)和1株球菌(金黃色葡萄球菌S.A.)，5株農業(yè)病原菌包括白菜黑斑(BCHB)、棉花枯萎(MHKW)、小麥赤霉(XMCM)、小麥全蝕(XMQS)以及柑橘炭疽(GJTJ)病菌。

2 實驗結果與分析

2.1 鮑魚組織中內生真菌的分離純化結果

48h后發(fā)現(xiàn)鮑魚各切面處逐漸有新的菌落出現(xiàn)，使用劃線法共純化出4株新生內生真菌，命名為A1、A2、A3和A4，詳見圖2。

A1菌株：生長初期有白色菌絲體，隨著時間的延長，呈現(xiàn)青綠色菌落，邊緣以及背面均為黃色。

A2菌株：生長初期亦呈白色菌絲，一段時間后中間菌絲漸變?yōu)榫G色，最后兩種顏色菌絲并存，蔓延至整個培養(yǎng)基平板，呈現(xiàn)“地毯狀”，背面呈現(xiàn)綠色。

A3菌株：菌絲初期為白色，后逐漸變?yōu)闇\綠色，呈粉末狀向周邊蔓延。

A4菌株：菌落呈現(xiàn)白色絮狀，疏松，背面菌落微紅。

圖2 從鮑魚組織中分離純化出的4株內生真菌Fig.2 4 strains of endophytic fungi isolated and purified from abalone

2.2 優(yōu)化培養(yǎng)實驗結果

2.2.1 次級代謝產物生產力篩選

由圖3可以發(fā)現(xiàn)，對于4種不同的培養(yǎng)基來說，發(fā)酵液中代謝產物量均多于菌絲體中的，初步推測胞外代謝可能強于胞內代謝；而對于固體RICE培養(yǎng)基來說，產物量最大。一般說來，為了獲得較大次級代謝產物量，靜置發(fā)酵時間最好是28d。

圖3 A1菌株次級代謝產物質量Fig.3 quality of A1 strain secondary metabolite

2.2.2 次級代謝產物抑菌活性篩選

對4株細菌抑菌活性篩選結果發(fā)現(xiàn)，A1菌株的PDB培養(yǎng)基對枯草芽孢桿菌(B.S.)有著較專一的抑菌活性，抑菌圈為18mm(陽性對照為24mm)；MH1培養(yǎng)基對金黃色葡萄球菌(S.A.)和大腸埃希氏桿菌(E.C.)有較好的抑菌活性，抑菌圈分別為17m(陽性對照為27mm)和21mm(陽性對照為29mm)；固體RICE培養(yǎng)基的粗提物對枯草芽孢桿菌(B.S.)和大腸埃希氏桿菌(E.C.)抑菌活性最好，抑菌圈分別為22mm和25mm。

對5株農業(yè)病原真菌篩選結果可以看出，4種不同的培養(yǎng)基粗提物均對白菜黑斑病菌有著較好的抑制作用，抑菌圈大約在15～18mm不等(陽性對照為22mm)，對小麥赤霉病菌抑制作用稍弱，抑菌圈在10～14mm(陽性對照為24mm)，其中仍然以RICE培養(yǎng)基的抑菌活性較高。

綜上所述，學生通過海邊采樣、菌種分離純化，從鮑魚中分離純化出4株內生真菌；由于受時間和實驗場地的限制，選擇長勢茂盛、形態(tài)奇特的菌株A1做優(yōu)化培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)其固體RICE培養(yǎng)基代謝產物量較大，抑菌活性也優(yōu)于其他培養(yǎng)基，可以作為后續(xù)深入研究對象，以期發(fā)現(xiàn)高抑菌活性組分，為綠色環(huán)保農藥研發(fā)提供有力的實驗基礎。

3 討論

通過本次開放實驗，學生們在初步科研訓練的基礎上，既擴充了環(huán)境微生物實驗技術，也進一步了解了海洋內生真菌的特殊分離純化操作方法，同時又對微生物中真菌的優(yōu)化培養(yǎng)做了進一步探討，還綜合熟練掌握了化學一些實驗操作技術，比如：萃取以及分液，旋轉蒸發(fā)儀的使用等。在開放試驗過程中，集學生文獻查閱、歸納總結、方案設計與討論、規(guī)劃每一步實驗操作于一體，使參與學生既受到了良好的科研訓練，擴大了學生知識面，也為學生的科技創(chuàng)新增加了新的思路，有利于應用型人才的培養(yǎng)。