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(1.浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院 ,浙江 杭州 310015;2.麗水海關(guān)檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)服務(wù)中心,浙江 麗水 323000)

靈芝(Ganoderma lucidum)是一種大型藥用真菌，屬于擔(dān)子綱多孔菌科靈芝屬真菌[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷代醫(yī)書均將其列為上品，具有補(bǔ)中益氣、延年益壽、扶正固本、滋陰強(qiáng)壯等功效。靈芝中主要含有多糖、三萜、核苷、生物堿、氨基酸多肽、微量元素等化學(xué)成分，其中三萜和多糖是靈芝最主要的兩大活性成分。竹靈芝是一種生長于云南、海南等地的喜熱靈芝(Ganoderma calidophilum)，因常盛產(chǎn)于竹林下富含腐竹葉的地表，民間通常稱之為"竹靈芝"。竹靈芝的菌蓋呈半圓形或近扇形，顏色為紫褐色或黑褐色，有似漆樣光澤，有同心環(huán)溝和環(huán)紋并有縱皺，邊緣鈍，直徑2.0～4.5 cm，厚0.3～1.0 cm；菌蓋背面白色或近白色[2]。菌柄一般背側(cè)生或背生，呈紫褐色或紫黑色，多彎曲，較細(xì)，長約5～12 cm，粗0.3～0.8 cm，有光澤。目前關(guān)于靈芝的化學(xué)成分及藥理活性的研究非常多[3-7]，但是針對(duì)竹靈芝的展開的研究還非常少，本文選取了云南竹靈芝作為研究對(duì)象，對(duì)其三萜的提取工藝進(jìn)行了研究。

1 材料與儀器

無水乙醇、乙酸乙酯、冰乙酸、高氯酸、香蘭素(以上試劑均為分析純)、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司)、竹靈芝(市售，采于云南文山)、容量瓶，電子分析天平，可見分光光度計(jì)(日本島津UV-124型)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取5mg熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品，用適量乙酸乙酯溶解，定容至50mL。分別移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL置于具塞試管中，置于90℃水浴中，揮干。再加入0.8mL的5%香草醛-冰乙酸溶液以及2mL的高氯酸溶液，混合均勻后，在65℃恒溫水浴中反應(yīng)15min，冷卻至室溫，用冰乙酸稀釋至10mL，振搖15min后，在波長為548.1 nm處的紫外分光光度計(jì)中測(cè)其吸光度，記錄數(shù)據(jù)，然后以熊果酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]。

2.2 竹靈芝中三萜成份的提取工藝優(yōu)化

2.2.1 乙醇濃度對(duì)竹靈芝中三萜得率的影響

精確稱取1.000g的靈芝子實(shí)體粉末4份，分裝于4個(gè)250mL的錐形瓶中，分別加入30mL 85%、90%、95%、100%的乙醇，在40℃、150W的超聲功率下提取20min，冷卻到室溫后轉(zhuǎn)移至50mL的容量瓶中，加乙醇定容至50mL，搖勻并過濾，吸取濾液1mL于25mL比色管中，與此同時(shí)參比比色管中加入1 mL 100%乙醇，按標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)液在548.1nm處的吸光度，計(jì)算三萜的得率。

2.2.2 不同料液比對(duì)竹靈芝中三萜得率的影響

精確稱取1.000g的靈芝子實(shí)體粉末4份，分裝于4個(gè)250mL的錐形瓶中，依次按料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入95%乙醇，在40℃、150W的超聲功率下提取20min，冷卻到室溫后轉(zhuǎn)移至50mL的容量瓶中，加乙醇定容至50mL，搖勻并過濾，吸取濾液1mL于25mL比色管中，與此同時(shí)參比比色管中加入1mL100%乙醇，按標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)液在548.1nm處的吸光度，計(jì)算三萜的得率。

2.2.3 提取溫度對(duì)竹靈芝中三萜得率的影響

精確稱取1.000g的靈芝子實(shí)體粉末4份，分裝于4個(gè)250mL的錐形瓶中，各加入30mL 95%乙醇，分別于40℃、50℃、60℃、70℃，150W的超聲功率下提取20min，冷卻到室溫后轉(zhuǎn)移至50mL的容量瓶中，加乙醇定容至50mL，搖勻并過濾，吸取濾液1mL于25mL比色管中，與此同時(shí)參比比色管中加入1mL100%乙醇，按標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)液在548.1nm處的吸光度，計(jì)算三萜的得率。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)竹靈芝中三萜得率的影響

精確稱取1.000g的靈芝子實(shí)體粉末4份，分裝于4個(gè)250mL的錐形瓶中，各加入30mL 95%乙醇，于40℃、150W的超聲功率下分別提取20，30，40，50min。冷卻到室溫后轉(zhuǎn)移至50mL的容量瓶中，加乙醇定容至50mL，搖勻并過濾，吸取濾液1mL于25mL比色管中，與此同時(shí)參比比色管中加入1mL 100%乙醇，按標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)液在548.1nm處的吸光度，計(jì)算三萜的得率。

2.2.5 正交實(shí)驗(yàn)

依據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以乙醇濃度(A)、料液比(B)、浸提溫度(C)、提取時(shí)間(D)為自變量，以靈芝三萜得率為評(píng)估指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9正交實(shí)驗(yàn)，考察各實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)靈芝中三萜得率的影響。再使用最佳提取條件，進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，測(cè)試提取工藝的穩(wěn)定性。

3 結(jié)果和分析

3.1 熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將測(cè)得的吸光度對(duì)熊果酸溶液的濃度進(jìn)行線性回歸分析，得出回歸方程為y=1.9938x-0.0129，R2=0.9978，表明熊果酸溶液在0.02至0.2 mg/L之間與吸光度線性關(guān)系良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 熊果酸濃度與吸光度之間的關(guān)系

Fig.1 Relationship between ursolic acid concentration and the absorbance

3.2 乙醇濃度對(duì)竹靈芝中三萜得率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，總體來講，隨著乙醇的濃度不斷提高，竹靈芝中三萜類化合物的提取效果越來越好。當(dāng)乙醇濃度為90%時(shí)，靈芝三萜得率僅為0.260%；而當(dāng)乙醇濃度為100%時(shí)，靈芝三萜類化合物提取得率最高，為1.070%，可能原因?yàn)槿祁惢衔锏臉O性普遍較小，隨著乙醇濃度的增加，提取液極性降低，更加容易溶解出靈芝三萜。

圖2 不同提取條件與三萜得率之間的關(guān)系

Fig.2 the extraction yield of triterpenoids under different extraction conditions

3.3 不同料液比對(duì)竹靈芝中三萜得率的影響

隨著提取溶劑的用量不斷增加，靈芝中提取得到三萜類化合物的得率不斷提升，料液比超過1∶25后，三萜類化合物的得率增加趨于平緩，甚至略微下降?？紤]到溶劑的利用率及經(jīng)濟(jì)價(jià)值等問題，料液比1∶25是較優(yōu)的提取料液比。

3.4 不同溫度對(duì)竹靈芝中三萜得率的影響

當(dāng)其它條件一定時(shí)，隨著溫度的增加，靈芝三萜的提取效果先增加后降低，在50℃時(shí)有相對(duì)較好的提取效果，提取得率達(dá)到了1.050%?？赡苁怯捎陔S著提取溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)變得更加激烈，從而加快了分子的運(yùn)動(dòng)，同時(shí)溶劑向靈芝內(nèi)部更好地滲透，促進(jìn)了有效成分在試劑中的溶出，有利于細(xì)胞內(nèi)三萜類化合物的浸出。當(dāng)提取溫度超過50℃后，靈芝三萜的提取得率隨著浸提溫度的上升反而下降，其原因可能是因?yàn)闇囟乳_始接近乙醇的沸點(diǎn)，導(dǎo)致乙醇的揮發(fā)量越來越大，從而導(dǎo)致了靈芝三萜的提取得率急劇下降。

3.5 不同提取時(shí)間對(duì)竹靈芝中三萜得率的影響

隨著超聲提取時(shí)間的增加，靈芝中三萜類物質(zhì)的提取得率先上升再下降，在30min時(shí)達(dá)到最高，提取得率達(dá)到了1.080%，而超過30min后，隨著超聲時(shí)間的增加，三萜類化合物的提取得率反而降低，懷疑是長時(shí)間的超聲處理破壞了靈芝中三萜類化合物的結(jié)構(gòu)，從而降低了靈芝三萜類化合物的提取得率。

3.6 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)以三萜類化合物的提取得率為檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，選取了乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間等四個(gè)因素，設(shè)計(jì)了4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，因素水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factor level of orthogonal experiment

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表Tab.2 Orthogonal experiment chart and result

由表2進(jìn)行極差分析可知，提取工藝參數(shù)對(duì)靈芝三萜類化合物提取得率的影響程度大小依次為：提取時(shí)間(D)>乙醇濃度(A)>浸提溫度(C)>料液比(B)，其中影響最大的是提取時(shí)間，影響最小的是料液比。最佳提取工藝條件應(yīng)選擇A1B1C1D1，提取得率為1.758%，即選擇100%的乙醇濃度，1∶20的料液比，40℃的浸提溫度，20min的提取時(shí)間。

3.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在上述最佳提取條件下，即100%的乙醇濃度，1∶20的料液比，40℃的浸提溫度，20min的提取時(shí)間條件下，進(jìn)行靈芝中三萜類化合物的提取試驗(yàn)，并進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)定靈芝三萜類化合物的提取得率，結(jié)果見表3。從表3可知該最佳試驗(yàn)方案所測(cè)定的靈芝三萜類化合物提取得率均優(yōu)于其它試驗(yàn)方案，且重復(fù)性較好，表明該提取方法穩(wěn)定可靠。

表3 最優(yōu)提取條件下靈芝三萜提取得率的平行試驗(yàn)

4 結(jié)論

(1)以熊果酸作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在濃度0.02至0.2 mg/mL范圍內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物與吸光度之間線性關(guān)系良好。

(2)以無水乙醇作為溶劑，在超聲輔助的情況下對(duì)云南竹靈芝中的三萜類化合物進(jìn)行提取，單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著乙醇濃度的增加，三萜類化合物的得率快速增加；隨著料液比增加，三萜類化合物的提取得率先增加再趨于平緩；隨著提取溫度的升高，提取得率先增加后減少，在50℃附近有最好的提取效果；隨著提取時(shí)間的增加，靈芝三萜提取得率先提高后降低。

(3)正交實(shí)驗(yàn)的極差分析表明實(shí)驗(yàn)條件中，各因素對(duì)提取得率的影響為提取時(shí)間(D)>乙醇濃度(A)>浸提溫度(C)>料液比(B)，由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出最佳提取工藝條件為100%的乙醇濃度，1∶20的料液比，40℃的浸提溫度，20min的提取時(shí)間。在該條件下對(duì)云南竹靈芝中的三萜類物質(zhì)進(jìn)行三次提取，三萜的得率平行性較好，且均高于單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)中的任何一次單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)，平均得率達(dá)到了1.757%。表明通過正交實(shí)驗(yàn)得到的實(shí)驗(yàn)條件提取效果較好，其平行性也非常好。