邱 赟 ，韓升霞 ，劉麗雅 ，沈阿靈 ，林于雄

（1.寧德市中醫(yī)院，福建 寧德 352100；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）屬常見(jiàn)腸道疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）、克羅恩?。╟rohn's disease，CD），其中以UC較為多見(jiàn)。 UC是一種反復(fù)發(fā)作、病因尚不明確的慢性非特異性腸道疾病，臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉以及粘液血便。近年來(lái)，炎癥性腸病的發(fā)病率成上升趨勢(shì)，已成為我國(guó)常見(jiàn)的消化道疾病之一［1-2］。新近研究發(fā)現(xiàn)：鈣衛(wèi)蛋白（calprotectin，CP）和干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎性因子相似，是中性粒細(xì)胞來(lái)源的炎性反應(yīng)蛋白，也因此被當(dāng)作一種新型的炎癥標(biāo)記物，已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)，在檢測(cè)炎癥性腸病的進(jìn)程中具有重要作用［3-4］。

閩產(chǎn)特色中成藥片仔癀（pien tze huang，PZH）至今已有450多年的歷史，是由漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司獨(dú)家生產(chǎn)的國(guó)家一級(jí)中藥保護(hù)品種，在國(guó)內(nèi)外享有較高知名度的中成藥品種之一。在長(zhǎng)期的臨床應(yīng)用中，片仔癀對(duì)包括急慢性肝炎在內(nèi)的許多炎癥相關(guān)性疾病都具有明確的治療作用［5］。為了進(jìn)一步探討片仔癀對(duì)UC的治療作用及其機(jī)制，本研究通過(guò)建立葡萄糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的UC小鼠模型，觀察片仔癀對(duì)UC小鼠鈣衛(wèi)蛋白和細(xì)胞炎癥因子的影響，以期為片仔癀的二次開(kāi)發(fā)提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 片仔癀（漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：2016020001），規(guī)格 3 g／粒，配制前用刮刀刮取適量片仔癀，用雙蒸水溶解配制成0.1 g／mL，于 4 ℃保存待用；葡萄糖硫酸鈉（DSS，美國(guó) MP Biomedicals公司）；CP、IFN-γ 和 IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；Bradford蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)BALB／c小鼠24只，體重為18～20 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 儀器 ELX800酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；AB204-N電子天平（瑞士Mettler toledo公司）；5417R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó) Eppendorf公司）。

1.4 分組及給藥 采用飲用含有3%DSS飲用水的方法誘導(dǎo)建立UC小鼠模型。將24只BABL／c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組和治療組各8只。正常組給與正常飲用水，模型組和治療組連續(xù)自由飲用含 3%DSS的飲用水 7 d［6-7］，從第 8天開(kāi)始模型組和治療組恢復(fù)給予正常飲用水，至第11天實(shí)驗(yàn)結(jié)束。在造模前1天，治療組開(kāi)始口服灌胃PZH 溶液（劑量為 234 mg／kg），每日給藥，正常組和模型組口服灌胃與PZH溶液等體積的生理鹽水。

1.5 疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，參考文獻(xiàn)［8］，采用盲法方式觀察并記錄小鼠體重、腹瀉和便血等臨床體征，按表1進(jìn)行評(píng)分［7-9］，表中3項(xiàng)指標(biāo)得分平均值即為DAI。

表1 DAI計(jì)算方法

1.6 血樣標(biāo)本和結(jié)腸組織標(biāo)本的采集 在第11天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠眼框采集血樣標(biāo)本，然后用頸椎脫臼法處死小鼠后，在冰上操作，由肛門(mén)向上截取結(jié)腸標(biāo)本，生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度并記錄；同時(shí)留取結(jié)腸樣本用于病理組織學(xué)檢測(cè)。

1.7 病理組織學(xué)檢測(cè) 取約1.0 cm結(jié)腸組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚組織切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理學(xué)變化。

1.8 IFN-γ、IL-6和CP的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫分析（ELISA）檢測(cè)小鼠血清中 IFN-γ、IL-6和 CP水平，詳細(xì)操作步驟參照試劑盒說(shuō)明。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料屬正態(tài)分布的以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體重、DAI和結(jié)腸長(zhǎng)度的比較 由表2可見(jiàn)：經(jīng)3%DSS可建立UC小鼠模型，片仔癀干預(yù)能夠顯著改善DSS誘導(dǎo)的UC。

2.2 各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)的變化 由圖1可見(jiàn)：正常組小鼠結(jié)腸黏膜完整，黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，腺體排列整齊、結(jié)構(gòu)清楚，有大量的杯狀細(xì)胞，未見(jiàn)顯著病理形態(tài)學(xué)改變；而模型組結(jié)腸組織黏膜結(jié)構(gòu)不完整，可見(jiàn)結(jié)腸黏膜脫落形成的潰瘍?cè)?，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)黏膜及黏膜下層，以中性粒細(xì)胞為主，并伴有少量淋巴、單核細(xì)胞，腺體正常結(jié)構(gòu)喪失，排列紊亂，腺腔消失；治療組中小鼠結(jié)腸壞死灶、潰瘍面積較模型組有所減少，黏膜和腺體排列與模型組比較較整齊，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)黏膜層及黏膜下層明顯減少?？梢?jiàn)，片仔癀能明顯緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎癥病變程度。

表2 各組小鼠體重、DAI和結(jié)腸長(zhǎng)度的比較

圖1 各組小鼠結(jié)腸的 HE染色結(jié)果（×100）

2.3 各組小鼠血清中IFN-γ、IL-6和CP水平變化比較 由表3可見(jiàn)：片仔癀可能通過(guò)抑制血清中IFN-γ、IL-6和CP的水平，起到緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎作用。

表3 各組小鼠血清中IFN-γ、IL-6和CP水平變化比較

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為UC的發(fā)生發(fā)展與遺傳性、免疫調(diào)節(jié)異常、感染和環(huán)境等因素有關(guān)，但對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚不完全明了。UC由于其病程長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)和緩解期與活動(dòng)期反復(fù)交替，因此世界衛(wèi)生組織定義其為現(xiàn)代難治疾病之一［10］。目前臨床常用治療藥物有糖皮質(zhì)激素制劑、5-氨基水楊酸制劑、生物制劑等［11］。但激素類(lèi)藥物具有降低抗感染的免疫力，可誘發(fā)上消化道出血、骨質(zhì)疏松等不良反應(yīng)；而5-氨基水楊酸類(lèi)藥物易引起腹瀉、惡心、皮疹等毒副作用。因此，尋找更為安全且療效好的治療藥物顯得尤為重要。而長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐證明，傳統(tǒng)的中藥復(fù)方對(duì)本病治療有積極作用，其標(biāo)本兼治、多途徑和毒副作用少等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)呈現(xiàn)出了巨大的開(kāi)發(fā)價(jià)值和潛力 ［12-14］。

片仔癀處方和工藝屬于國(guó)家絕密級(jí)組方，目前公開(kāi)的處方為三七、牛黃、麝香、蛇膽等4味藥材，具有顯著的清熱解毒、涼血化瘀、消腫止痛功效。本研究結(jié)果表明：片仔癀對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠具有良好療效，經(jīng)片仔癀治療后可抑制DSS誘導(dǎo)的體重下降、DAI評(píng)分增加和結(jié)腸縮短，以及減少模型小鼠結(jié)腸的潰瘍?cè)詈脱仔约?xì)胞浸潤(rùn)。

IFN-γ和IL-6是Th1型細(xì)胞因子的重要組成部分，二者均是促炎癥細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中起著重要的作用。近年來(lái)的許多研究已經(jīng)證實(shí)，IFN-γ和IL-6及其信號(hào)傳導(dǎo)通路參與了UC的發(fā)生發(fā)展［15-17］。臨床研究表明：UC患者血清中IFN-γ和IL-6的含量會(huì)顯著增加［18-19］。CP是一種來(lái)源于中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的含鈣蛋白，其表達(dá)具有組織或細(xì)胞特異性，是嗜中性粒細(xì)胞的主要炎性反應(yīng)蛋白。中性粒細(xì)胞的脫顆?？舍尫臗P，是中性粒細(xì)胞更新的重要標(biāo)志物［20-21］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)：CP作為一種新型急性炎癥標(biāo)志物，在UC患者中明顯升高［3，22］。本研究結(jié)果顯示：IFN-γ、IL-6 和 CP 在UC模型組小鼠血清中的含量與正常組比較明顯升高，片仔癀可以有效地抑制IFN-γ、IL-6和CP含量的增加，說(shuō)明抑制IFN-γ、IL-6和CP含量的增加可能是片仔癀治療UC的作用機(jī)制之一。

綜上所述，UC發(fā)生發(fā)展是多因素、多環(huán)節(jié)作用的結(jié)果，而片仔癀治療具有多成分、多途徑的作用機(jī)制特點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，我們將繼續(xù)深入開(kāi)展片仔癀治療UC作用機(jī)制研究，以期闡明片仔癀治療UC的作用機(jī)理、靶點(diǎn)和通路，為擴(kuò)大片仔癀的臨床適應(yīng)癥和為其二次開(kāi)發(fā)提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。