陳 磊,劉書東,倪文浩,賀三剛,李文蓉

(新疆畜牧科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部草食家畜繁育生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830000)

梅迪-維斯納病是由綿羊進(jìn)行性肺炎病毒引起的成年綿羊的慢性接觸性傳染病[1-3]，該病以中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肺和流向這些組織的淋巴結(jié)的單核細(xì)胞浸潤為特征[4-5]，給養(yǎng)羊業(yè)造成不同程度的經(jīng)濟(jì)損失。近期的研究發(fā)現(xiàn)，綿羊跨膜蛋白154基因(Transmembrane protein 154，TMEM154)第2外顯子G103A(E35/K35)位點(diǎn)的多態(tài)性與進(jìn)行性肺炎的發(fā)生密切相關(guān)，TMEM154蛋白第35位氨基酸(E35)為谷氨酸時(shí)綿羊?qū)M(jìn)行性肺炎病毒具有易感性，而為賴氨酸(K35)時(shí)綿羊?qū)υ摬《颈憩F(xiàn)為抗性[6-7]。與此同時(shí)，Heaton等[8]研究也發(fā)現(xiàn)，攜帶單拷貝E35等位基因的綿羊進(jìn)行性肺炎的易感風(fēng)險(xiǎn)比非攜帶者高2.85倍。此外，鑒于綿羊進(jìn)行性肺炎在所有養(yǎng)羊國家或地區(qū)均發(fā)生過大規(guī)模的流行[9-11], Heaton等[12]對來自多個(gè)國家的74個(gè)品種2 819只綿羊的TMEM154基因多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，與綿羊進(jìn)行性肺炎病毒易感相關(guān)的TMEM154基因E35等位基因頻率在上述綿羊群體中達(dá)到51%，說明多數(shù)綿羊品種對進(jìn)行性肺炎普遍易感。由此可知，提高綿羊群體中TMEM154 K35等位基因頻率，降低或消除易感性強(qiáng)的E35等位基因頻率，能夠?yàn)橛行Э刂凭d羊進(jìn)行性肺炎病毒的傳播發(fā)揮重要作用。雖然國外研究人員對不同品種綿羊TMEM154基因的多態(tài)性與綿羊進(jìn)行性肺炎易感性/抗性進(jìn)行了研究[1，13-15]，但目前尚未開展新疆地方綿羊品種TMEM154基因的遺傳多態(tài)性分析，TMEM154基因與新疆地方綿羊品種進(jìn)行性肺炎的易感性/抗性的遺傳規(guī)律亦尚未闡明。因此，開展新疆地方品種綿羊TMEM154基因多態(tài)性的研究，能夠有效預(yù)防和控制綿羊進(jìn)行性肺炎病毒在新疆地區(qū)的傳播。本研究分析了新疆地區(qū)8個(gè)綿羊品種TMEM154基因第2外顯子G103A(E35/K35)位點(diǎn)的基因多態(tài)性，明確新疆地區(qū)主要綿羊品種TMEM154基因的多態(tài)性以及對綿羊進(jìn)行性肺炎的抗性和易感性基因型分布規(guī)律，從而為從遺傳學(xué)方面控制新疆主要地方綿羊品種進(jìn)行性肺炎的傳播提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選擇新疆地區(qū)6個(gè)地方綿羊品種(阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊)和2個(gè)培育品種(中國美利奴羊和德國美利奴羊)共520只綿羊個(gè)體為試驗(yàn)材料(表1)，采集綿羊頸靜脈全血或耳組織，EDTA抗凝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 樣本來源

1.2 主要試劑

2×TransTaq-T PCR SuperMix和100 bp DNA Ladder購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；Tris平衡酚購于北京索萊寶科技有限公司；其他試劑為分析純產(chǎn)品。

1.3 血液或耳組織DNA提取

采用酚/氯仿法提取綿羊血液或耳組織DNA，利用Nano Drop 2000核酸分析儀檢測提取的綿羊血液和耳組織樣本DNA的濃度和純度，然后使用0.8%普通瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，最后將抽提好的樣本DNA用ddH2O逐一稀釋至終濃度為100 ng/μL，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

利用Oligo 7.0軟件對GenBank 上發(fā)表的綿羊TMEM154基因序列(GenBank 登錄號: NC_019474.1)存在堿基變化的外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)引物，上游引物: 5′-gcctttgtgggagattta-3′;下游引物: 5′-aattttggaaaatgtcactga-3′, 預(yù)期擴(kuò)增片段為745 bp,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR 擴(kuò)增體系(50 μL): 2×TransTaq-T PCR SuperMix 25 μL , 上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL, DNA 模板1 μL,ddH2O 補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s, 57 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min 30 s, 35 個(gè)循環(huán)后 72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存。吸取5 μL PCR 產(chǎn)物用1%的普通瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并將純化后的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果，分析和計(jì)算TMEM154基因第2外顯子G103A位點(diǎn)在新疆地區(qū)8個(gè)綿羊品種中的基因型和等位基因頻率；利用χ2檢驗(yàn)分析是否符合Hardy-Weinberg 平衡定律；根據(jù)分析獲得的TMEM154第2外顯子G103A位點(diǎn)的基因型，將新疆地方綿羊品種分為對進(jìn)行性肺炎具有易感性與抗性兩類，然后進(jìn)行等位基因頻率G/A比值與綿羊進(jìn)行性肺炎易感性的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增

以綿羊的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增獲得含有TMEM154基因第2外顯子G103A位點(diǎn)的特異性目的片段，該片段與預(yù)期片段745 bp，其電泳結(jié)果如圖1所示。

圖1 綿羊TMEM154第2外顯子G103A位點(diǎn)PCR擴(kuò)增結(jié)果M.DNA marker 100 bp；1-4.PCR 產(chǎn)物

2.2 TMEM154基因第2外顯子G103A位點(diǎn)的PCR測序分析

利用PCR測序法分別對阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊、巴什拜羊、德國美利奴羊和中國美利奴羊等8個(gè)綿羊品種的TMEM154基因第2外顯子G103A位點(diǎn)進(jìn)行檢測，共發(fā)現(xiàn)3種不同的基因型：AA、AG和GG(圖2)。中國美利奴羊、德國美利奴羊和哈薩克羊群體均檢測出3種基因型，阿勒泰羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊缺少AA基因型。

圖2 TMEM154基因第2外顯子103位點(diǎn)測序分析

2.3 G103A位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率以及群體遺傳學(xué)分析

如表2所示，新疆地區(qū)6個(gè)地方綿羊品種中阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊群體TMEM154基因第2外顯子103位點(diǎn)以GG為主要基因型，同時(shí)AG基因型在阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊中的基因型頻率分別為11.00%、22.00%、6.00%、8.00%、11.00%和20.00%；而AA基因型在哈薩克羊群體中比率僅為1.70%，阿勒泰羊、多浪羊、策勒黑羊、巴什拜羊和巴音布魯克羊群體中沒有檢測出AA基因型，因此阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊是進(jìn)行性肺炎高敏感的綿羊品種。在中國美利奴羊和德國美利奴羊群體中AA基因型為優(yōu)勢基因型，頻率分別達(dá)到63.00%和52.00%，AG基因型頻率分別為29.00%和24.00%，中國美利奴羊GG基因型頻率最低僅為8.00%，由此可知，中國美利奴和德國美利奴是進(jìn)行性肺炎低敏感綿羊品種。等位基因分析發(fā)現(xiàn)：在中國美利奴羊群體中，與進(jìn)行性肺炎抗性相關(guān)A等位基因頻率高達(dá)0.78，G等位基因頻率僅為0.22。

2.4 TMEM154基因第2外顯子G103A位點(diǎn)等位基因頻率比值與進(jìn)行性肺炎易感性的相關(guān)性分析

如圖3所示，等位基因G/A的比值可能與綿羊品種進(jìn)行性肺炎易感性呈正相關(guān)。進(jìn)行性肺炎高敏感的巴音布魯克羊等位基因G/A的比值為30.25，而進(jìn)行性肺炎低敏感的中國美利奴羊等位基因G/A的比值僅為0.29，這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)群體等位基因G/A的比值相差約104.31倍以上。進(jìn)行性肺炎高敏感的阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊群體與進(jìn)行性肺炎低敏感的中國美利奴羊和德國美利奴羊群體之間等位基因G/A的比值呈現(xiàn)顯著差異，說明進(jìn)行性肺炎高敏感的綿羊品種與進(jìn)行性肺炎低敏感的綿羊群體間基因型頻率存在明顯差異。

表2 不同基因型頻率和等位基因頻率

圖3 G103A位點(diǎn)基因頻率G/A比值
注：*表示差異顯著(P<0.05)。

Fig.3 G/A ratio of G103A locus alleles frequency
Note: * indicates significant difference (P<0.05).

3 討 論

綿羊進(jìn)行性肺炎在新疆各地、州和種羊場均曾廣泛傳播，給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病在動(dòng)物疫病中屬于2類疫病，綿羊感染后表現(xiàn)為慢性、進(jìn)行性、間質(zhì)性肺炎，最后因器官衰竭、缺氧導(dǎo)致綿羊死亡[16-17]。Heaton等[8]研究發(fā)現(xiàn)，不同的綿羊品種和不同的年齡階段，綿羊進(jìn)行性肺炎陽性分布率及發(fā)生均存在顯著的差異。此外，研究人員在對綿羊進(jìn)行性肺炎研究及防治過程中發(fā)現(xiàn)，不同品種綿羊?qū)M(jìn)行性肺炎病毒易感性存在差異，究其實(shí)質(zhì)可能與不同綿羊品種的遺傳背景存在差異有關(guān)。因此，從分子水平深入研究綿羊進(jìn)行性肺炎發(fā)生的分子機(jī)制與調(diào)控機(jī)理，尋找影響綿羊進(jìn)行性肺炎發(fā)生的關(guān)鍵基因或分子標(biāo)記，對新疆乃至全國優(yōu)秀地方品種綿羊的抗病育種尤為關(guān)鍵。

分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)已經(jīng)在動(dòng)、植物優(yōu)良性狀的輔助選擇育種中得到廣泛的應(yīng)用[18-22]，該技術(shù)能夠準(zhǔn)確地分析個(gè)體遺傳組成，實(shí)現(xiàn)對基因型的直接選擇并進(jìn)行分子育種。本研究對新疆地區(qū)主要綿羊品種TMEM154基因的多態(tài)性以及對綿羊進(jìn)行性肺炎的抗性和易感性基因型分布規(guī)律開展研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新疆8個(gè)地方綿羊品種TMEM154基因第2外顯子G103A多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率均存在較大差異，χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明，阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊在G103A位點(diǎn)均偏離了Hardy-Weinberg平衡規(guī)律(P>0.05)(表2)，推測阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊可能受到基因突變、遷移、自然選擇等因素的影響，符合新疆當(dāng)?shù)丶兎N阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊雜交數(shù)量增多這一情況。同時(shí)，分析發(fā)現(xiàn)與綿羊進(jìn)行性肺炎易感相關(guān)的GG基因型在阿勒泰羊、哈薩克羊、多浪羊、巴音布魯克羊、策勒黑羊和巴什拜羊等新疆地方綿羊品種中屬于優(yōu)勢基因型，而在中國美利奴羊和德國美利奴羊群體基因型頻率較低，而與綿羊進(jìn)行性肺炎抗性相關(guān)的AA基因型在這8個(gè)綿羊群體中的分布情況與GG基因型剛好相反。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，哈薩克羊、德國美利奴羊和中國美利奴羊群體中AG基因型頻率較高，這可能是由于哈薩克羊、德國美利奴羊和中國美利奴羊群體在本地區(qū)的品種改良過程中引入其他綿羊品種基因所導(dǎo)致。

TMEM154基因位于綿羊第17號染色體，具有7個(gè)外顯子，編碼191個(gè)氨基酸，綿羊TMEM154基因與人、鼠和牛序列具有67.3%、53.8%和92.5%的相似性[8]。目前的研究表明，該基因與人類和動(dòng)物相關(guān)疾病的發(fā)生過程具有一定的相關(guān)性。在對人類的研究中發(fā)現(xiàn)，TMEM154基因的表達(dá)與哮喘病發(fā)生的嚴(yán)重程度緊密相關(guān)，在呼吸系統(tǒng)中該基因的功能具有很強(qiáng)的保守性[14]；同時(shí)，TMEM154基因在小鼠組織表達(dá)譜的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因僅在乳腺組織中特異性表達(dá)，但其作用機(jī)制尚未可知[23]；此外，對綿羊TMEM154基因部分敲除試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TMEM154基因的功能性缺失可以提高綿羊?qū)M(jìn)行性肺炎的抗病性[8]。本實(shí)驗(yàn)室對巴音布魯克和中國美利奴羊開展重測序技術(shù)，利用FST的方法亦篩選獲得收到選擇的TMEM154基因，從而為本研究的開展提供有利的佐證。目前，盡管發(fā)現(xiàn)TMEM154基因與綿羊進(jìn)行性肺炎的易感性相關(guān)，但對該基因在進(jìn)行性肺炎病毒感染過程中的作用機(jī)制仍待進(jìn)一步深入研究，因此后續(xù)通過增加不同品種綿羊群體數(shù)、擴(kuò)大樣本量，深入開展該SNP位點(diǎn)與綿羊進(jìn)行性肺炎易感性的相關(guān)性分析，將為利用該SNP位點(diǎn)進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種具有一定的理論指導(dǎo)和實(shí)踐意義。

4 結(jié) 論

TMEM154基因第2外顯子G103A SNP位點(diǎn)的GG基因型在阿勒泰羊、哈薩克羊、多浪羊、巴音布魯克羊、策勒黑羊和巴什拜羊群體中屬于優(yōu)勢基因型，而在中國美利奴羊和德國美利奴羊群體中該基因型頻率僅分別為8.00%和24.00%。進(jìn)行性肺炎高敏感的阿勒泰羊、哈薩克羊、巴音布魯克羊、多浪羊、策勒黑羊和巴什拜羊群體G103A位點(diǎn)的基因型頻率和進(jìn)行性肺炎低敏感的中國美利奴羊和德國美利奴羊存在顯著差異，等位基因頻率A/G與進(jìn)行性肺炎密切相關(guān)。由于該位點(diǎn)SNP與進(jìn)行性肺炎易感性具有較強(qiáng)的相關(guān)性，因此可以作為新疆乃至全國進(jìn)行性肺炎易感性綿羊品種的候選分子標(biāo)記。