任金威，李 迪，孫靖琴，劉欣然，張召鋒，王軍波，李 勇

(北京大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學系，北京 100191)

當機體缺氧時，不僅會影響機體內(nèi)神經(jīng)、消化、呼吸、泌尿、內(nèi)分泌等各個系統(tǒng)的生理功能，還會影響機體內(nèi)碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類、水和電解質(zhì)等各種物質(zhì)的代謝過程，嚴重危害生物體的健康[1-3]。其具體癥狀一般包括心跳加快、口干，進一步可出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉、心悸、呼吸短促，更甚者出現(xiàn)全身乏力、昏迷、休克等[3-4]。因此，尋求安全有效的防治缺氧的措施，以減少缺氧及相關(guān)疾病的發(fā)生，具有重要的科學價值和社會意義。在很長的一段時期內(nèi)，國內(nèi)外關(guān)于耐缺氧的研究主要集中在尋找預防和治療缺氧的藥物上。近年來，學者們的研究目光開始轉(zhuǎn)向食品領域，已有大量研究證實，天然食物成分在改善缺氧方面是安全有效的。

生物活性肽(BAP)是指對生物機體的生命活動有益或具有生理作用的肽類化合物[5]。研究發(fā)現(xiàn)，機體對低聚肽的吸收和代謝速度比對游離氨基酸快[6]。另外，BAP類具有廣泛的生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗高血壓、降膽固醇、抗氧化和清除自由基作用等。目前BAP以其高效、安全的特點異軍突起，逐漸顯示出其在臨床營養(yǎng)中的重要作用和廣泛的應用前景[5]。

2012年9月4日，中國衛(wèi)生部批準人參成為新資源食品，人參的應用將由單一的中藥材拓展到食品、飲料及保健產(chǎn)品等領域，范圍大幅擴大，這為我國的人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了新的契機[7]。研究發(fā)現(xiàn)，人參具有顯著的耐缺氧作用[8-9]。對人參提取物人參皂苷的研究也表明，人參皂苷rgl[10]、Rb1[11-12]等均有改善缺氧耐受力的作用。

人參低聚肽雖然作為一類重要的化合物存在于人參組織中，但其功能研究較少報道。低聚肽在人體內(nèi)不需消化可直接吸收，比單個氨基酸吸收更有效，可直接參與蛋白質(zhì)的合成[5]，可避免活性物質(zhì)的浪費，大大提高其生理調(diào)節(jié)作用。本實驗通過常壓耐缺氧實驗、亞硝酸鈉中毒存活實驗和急性腦缺血性缺氧實驗，觀察吉林人參低聚肽(ginseng oligopeptides，GOP)水溶液的耐缺氧效果，為缺氧的營養(yǎng)干預和GOP功能性食品開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

健康SPF級成年雄性BALB/C小鼠180只，適應期結(jié)束時，體重18～22 g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(京)2011-0012。分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲食、飲水。動物飼養(yǎng)實驗室符合國標清潔級，溫度范圍為22±2℃，相對濕度為50%～60%，晝∶ 夜明暗交替時間為12h∶ 12h。

GOP，淡黃色固體粉末，利用生物酶解技術(shù)從吉林人參中分離得到的小分子生物活性肽的混合物，混合物主要以小分子低聚肽為主，分子量小于1 000，質(zhì)量分數(shù)為95.42%，吉林肽谷生物工程有限責任公司；鈉石灰，AR，成都金山化學試劑有限公司；亞硝酸鈉，AR，重慶百倍精細化工廠；凡士林。

1.2 儀器與設備

AdventurerTM通用型分析天平，美國奧豪斯國際貿(mào)易有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1常壓耐缺氧實驗 取60只BALB/C小鼠，按體重隨機分成6組，每組10只。實驗設立4個GOP劑量組[0.075、0.150、0.300、0.600g/(kg·BW)]、1個空白對照組和1個乳清蛋白組[0.300g/(kg·BW)]。分組后，4個劑量組每天灌胃給予不同濃度的GOP水溶液，空白對照組每日灌胃給予同體積的蒸餾水，乳清蛋白組給予同體積乳清蛋白水溶液。灌胃量為1mL/100g，每日1次。乳清蛋白水溶液和GOP水溶液均用蒸餾水配制。所有的動物每周均稱量體重1次，按體重水平調(diào)整灌胃量，實驗結(jié)束時最后1次稱重。每日觀察小鼠的食欲行為、狀態(tài)、毛發(fā)及動物死亡情況。連續(xù)灌胃干預30d。在動物末次灌胃后1h，將各組動物放入250mL磨口瓶內(nèi)(瓶內(nèi)盛有5g鈉石灰)，每瓶1只，用凡士林密封瓶口，保證不漏氣。立即計時，記錄小鼠因缺氧而停止呼吸的時間。

1.3.2亞硝酸鈉中毒存活實驗 動物分組及干預方法同1.3.1，在動物末次灌胃后1h，各組動物腹腔注射亞硝酸鈉溶液，注射劑量為240mg/(kg·BW)，注射量為0.1mL/10g。立即計時，記錄小鼠存活時間。

1.3.3急性腦缺血性缺氧實驗 動物分組及干預方法同1.3.1，在動物末次灌胃后1h，各組小鼠逐只自頸部斷頭，立即按下秒表，記錄動物自斷頭后至張口喘氣停止的時間。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果與分析

2.1 GOP對小鼠常壓缺氧存活時間的影響

實驗結(jié)束時，與空白對照組比較，乳清蛋白組及人參肽A、B、C、D劑量組常壓耐缺氧存活時間均顯著延長，延長率分別為8.8%、24.5%、41.5%、47.3%和53.8%，上述差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與乳清蛋白組比較，人參肽A、B、C、D劑量組小鼠常壓耐缺氧存活時間均顯著延長，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

表1人參肽對小鼠常壓耐缺氧存活時間的影響

組別動物數(shù)(只)劑量[g/(kg·BW)]存活時間(min)延長率(%)空白對照組10036.67±3.86—乳清蛋白組100.15039.91±3.998.8人參肽A劑量組100.07545.66±3.49ab24.5人參肽B劑量組100.15051.89±3.06ab41.5人參肽C劑量組100.30054.03±4.05ab47.3人參肽D劑量組100.60056.42±8.23ab53.8

注：a與空白對照組比較差異有顯著性(P<0.05)；b與乳清蛋白組比較差異有顯著性(P<0.05)

2.2 GOP對小鼠亞硝酸鈉中毒所致缺氧存活時間的影響

實驗結(jié)束時，與空白對照組相比，人參肽B、C、D劑量組存活時間顯著延長，延長率分別為23.6%、41.4%、45.9%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與乳清蛋白組比較，人參肽C、D劑量組存活時間均顯著延長，上述差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表2)。

表2人參肽對小鼠亞硝酸鈉中毒所致缺氧存活時間的影響

組別動物數(shù)(只)劑量[g/(kg·BW)]存活時間(min)延長率(%)空白對照組10018.56±1.37—乳清蛋白組100.15021.44±2.3215.5人參肽A劑量組100.07521.46±1.2915.6人參肽B劑量組100.15022.94±5.19a23.6人參肽C劑量組100.30026.25±4.92ab41.4人參肽D劑量組100.60027.08±5.73ab45.9

注：a與空白對照組比較差異有顯著性(P<0.05)；b與乳清蛋白組比較差異有顯著性(P<0.05)

2.3 GOP對小鼠急性腦缺血性缺氧存活時間的影響

實驗結(jié)束時，與空白對照組相比，人參肽A、B、C、D劑量組存活時間顯著延長，延長率分別為4.5%、11.0%、11.0%和9.0%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與乳清蛋白組比較，人參肽B、C、D劑量組存活時間顯著延長，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表3)。

表3人參肽對小鼠急性腦缺血性缺氧存活時間的影響

組別動物數(shù)(只)劑量[g/(kg·BW)]存活時間(min)延長率(%)空白對照組10020.00±0.67—乳清蛋白組100.15020.10±0.880.5人參肽A劑量組100.07520.90±0.88a4.5人參肽B劑量組100.15022.20±0.92ab11.0人參肽C劑量組100.30022.20±1.48ab11.0人參肽D劑量組100.60021.80±0.92ab9.0

注：a與空白對照組比較差異有顯著性(P<0.05)；b與乳清蛋白組比較差異有顯著性(P<0.05)

3 討論

氧是維持正常生命活動所必需的物質(zhì)。缺氧是臨床上常見的病理過程，是導致病人死亡的重要原因之一[13]。一般來說，輕度缺氧主要引起機體的代償反應，而嚴重缺氧則可導致組織細胞發(fā)生嚴重損傷和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外呼吸和循環(huán)等主要系統(tǒng)功能障礙甚而功能衰竭[14]。因此，尋找有效的耐缺氧藥物，減少缺氧的危害，對人類的健康有著十分重要的意義。

單純的蛋白質(zhì)攝入增加可能會對耐缺氧功能有一定的影響，乳清蛋白是牛乳中酪蛋白沉淀分離時保留在上清液中的多種蛋白質(zhì)組分的統(tǒng)稱，其在消化過程中產(chǎn)生多種生物活性多肽，具有提高免疫力、抗疲勞、抗氧化、耐缺氧等多種功效[15]。因此，為了排除因單純增加蛋白質(zhì)的攝入而引起的假陽性結(jié)果，本研究另設了乳清蛋白組作為對照組。本研究顯示，實驗結(jié)束時，與空白對照組和乳清蛋白組相比，GOP均可明顯延長小鼠常壓耐缺氧存活時間、亞硝酸鈉所致缺氧存活時間和急性腦缺血性缺氧存活時間。

常壓密閉環(huán)境下，由于供氧不足，導致動脈血氧含量減少，從而導致細胞內(nèi)氧分壓嚴重降低，致使線粒體用氧障礙而影響機體能量代謝。本研究顯示，與空白對照組相比，人參肽各劑量組常壓耐缺氧存活時間分別延長了24.5%、41.5%、47.3%和53.8%，乳清蛋白組延長了8.8%，說明人參肽可提高小鼠常壓耐缺氧功能，且效果優(yōu)于乳清蛋白。這可能與人參肽能夠提高小鼠血氧飽和度和減少機體耗氧量有關(guān)。

亞硝酸鈉中毒是由于亞硝酸鈉使正常二價鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槿齼r鐵血紅蛋白，破壞血紅蛋白攜氧能力，造成組織缺氧死亡[16]。本研究顯示，人參肽B、C、D劑量組亞硝酸鈉中毒存活時間較空白對照組分別延長了23.6%、41.4%和45.9%，而乳清蛋白組存活時間無顯著增長，提示人參肽可改善小鼠亞硝酸鈉中毒導致的缺氧狀況，而乳清蛋白暫未顯示此作用。推測人參肽可能通過緩解小鼠細胞外液的缺氧狀況，提高小鼠細胞對氧的利用效率，增加血紅蛋白的含量，從而延長小鼠缺氧的存活時間。另一方面，該作用也可能與人參肽具有抗氧化作用有關(guān)，具體機制尚待進一步研究和探討。

小鼠自頸部斷頭后，大腦雖供血終止，但腦中原有的營養(yǎng)物質(zhì)和血液尚能夠暫時維持大腦功能，從而使小鼠可以有規(guī)律地張口喘氣。觀察動物自斷頭后至張口喘氣停止的時間，可以評價人參肽對急性腦缺血性缺氧的保護作用。本研究結(jié)果表明，實驗結(jié)束時，與空白對照組比較，人參肽各劑量組急性腦缺血性缺氧存活時間分別延長了4.5%、11.0%、11.0%和9.0%，而乳清蛋白組存活時間延長不顯著。提示人參肽可以緩解小鼠急性腦缺血性缺氧，而乳清蛋白無此作用。這可能與人參肽增強了神經(jīng)細胞的耐缺氧能力有關(guān)。

本研究表明，實驗結(jié)束時，與空白對照組比較，人參肽4個劑量組常壓耐缺氧存活時間和急性腦缺血性缺氧存活時間均顯著延長；除A劑量組外，其余各組亞硝酸鈉中毒存活時間顯著延長。與乳清蛋白組相比，人參肽4個劑量組常壓耐缺氧存活時間均顯著延長；C、D劑量組亞硝酸鈉中毒存活時間顯著延長；B、C、D劑量組急性腦缺血性缺氧存活時間顯著延長。因此，本實驗結(jié)果表明，GOP能延長小鼠常壓耐缺氧存活時間、亞硝酸鈉所致缺氧存活時間和急性腦缺血性缺氧存活時間。

4 結(jié)論

本研究通過常壓耐缺氧實驗、亞硝酸鈉中毒存活實驗和急性腦缺血性缺氧實驗，設立空白對照組和乳清蛋白組作為對照組，探討GOP對小鼠耐缺氧作用的影響。結(jié)果提示，GOP能延長小鼠常壓耐缺氧存活時間、亞硝酸鈉所致缺氧存活時間和急性腦缺血性缺氧存活時間，表明GOP具有耐缺氧作用，具備作為一種新型耐缺氧制劑的潛力，有關(guān)其耐缺氧作用的深層機制尚有待進一步的研究與探討?！?/p>