劉娟汝，劉雨詩(shī)，郭力，李美鳳,2，葉強(qiáng)*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 教育部中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，成都 611137)

香菇(Lentinusedodes)為真菌門(mén)、擔(dān)子菌綱、傘菌科植物香菇的子實(shí)體，因其營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美，素有“植物皇后”之美譽(yù)，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。香菇富含多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，現(xiàn)代研究證明香菇多糖具有較好的抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等活性[1]。香菇中主要的呈鮮物質(zhì)是氨基酸與核苷酸，如谷氨酸、天門(mén)氨基酸和5'-核苷酸等，均是重要的呈鮮物質(zhì)，其中5'-鳥(niǎo)苷酸增鮮作用最強(qiáng)，在味精中微量加入就能呈現(xiàn)出高于普通味精上百倍的鮮味[2]，目前廣泛使用酶解法提取其中的鮮味物質(zhì)。隨著人們對(duì)香菇營(yíng)養(yǎng)成分與藥用價(jià)值認(rèn)識(shí)的不斷提高，其在功能性復(fù)合調(diào)味品的開(kāi)發(fā)方面具有廣闊前景。

通江香菇是四川省通江縣的優(yōu)質(zhì)資源，肉質(zhì)肥厚，味道鮮美，本課題組前期已利用通江香菇開(kāi)發(fā)成曲奇餅干[3]。在此基礎(chǔ)上，本研究利用香菇富含多種呈味物質(zhì)的特性，以通江香菇為原料，考察其最佳提取工藝，并設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化通江香菇風(fēng)味固體調(diào)味料(以下簡(jiǎn)稱通江香菇調(diào)味料)配方，確定其最優(yōu)配方及制作工藝，擴(kuò)大通江香菇的利用。

1 材料

1.1 材料與試劑

通江香菇：由四川省通江山霸王野生食品有限公司提供；精純鹽、白砂糖、國(guó)泰味精(谷氨酸鈉≥99%)、淀粉：均為市售；麥芽糊精：山東西王糖業(yè)有限公司；纖維素酶：深圳恒生生物科技有限公司，10萬(wàn)U/g；中性蛋白酶：南寧龐博生物工程有限公司，2萬(wàn) U/g；鉛元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號(hào)：GSB04-1742-2004)：國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；茚三酮(批號(hào)：2016110801)、乙酸、乙酸鈉等試劑(均為分析純)：成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器

UV2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、AA-6800 原子分光光度計(jì)、ASC-6100自動(dòng)進(jìn)樣器、GFA-EX7 石墨爐電源 日本島津公司；Sartorius BP121S型電子分析天平 德國(guó)賽多利斯有限公司；Sanxin MP511 pH計(jì) 上海三信儀表廠；Milestone Ethos Tos微波消解萃取儀 意大利Milestone公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 總氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取谷氨酸對(duì)照品5 mg，精密稱定為5.15 mg，加超純水定容至10 mL，制成每1 mL含谷氨酸0.515 mg的對(duì)照品溶液。分別精密量取對(duì)照品溶液1，1.1，1.2，1.4，1.5 mL，置于10 mL容量瓶中，依次加入pH為5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液2 mL、1%茚三酮溶液3 mL，搖勻后于沸水浴中加熱15 min，取出后迅速冷卻，加超純水定容至刻度，于570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以谷氨酸濃度為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？偘被針?biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1：Y=9.5898X-0.1375，R2=0.9990，吸光度在0.35～0.60之間線性良好。

圖1 總氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 氨基酸含量的測(cè)定

將香菇提取液加超純水定容至100 mL，精密量取1 mL于25 mL容量瓶中，按2.1項(xiàng)下顯色，于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算氨基酸含量。

式中：W為氨基酸含量，%；m1為樣品中氨基酸的質(zhì)量，mg；m2為樣品質(zhì)量，mg。

2.3 超聲輔助酶解法提取香菇的工藝優(yōu)化

2.3.1 提取流程

將香菇低溫干燥，粉碎過(guò)篩。取香菇粉5 g于錐形瓶中，加入10倍量純水，檸檬酸調(diào)節(jié)pH，加入纖維素酶與中性蛋白酶，混勻，于45 ℃超聲酶解[4]，然后置于45 ℃水浴1 h。取出，沸水浴滅酶15 min，離心、過(guò)濾，得香菇酶解液。

2.3.2 單因素與正交設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用超聲輔助酶解法提取香菇中的呈味物質(zhì)，以氨基酸含量為指標(biāo)，選擇影響氨基酸溶出度的4個(gè)主要因素，通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定參數(shù)取值范圍，并采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件。確定單因素如下：酶添加量為1.75%，2%，2.25%，2.5%，2.75%；纖維素酶和中性蛋白酶比例為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4；超聲時(shí)間為20，30，40，50 min；酶解pH為5.0，5.5，6.0，6.5，考察各參數(shù)對(duì)提取效率的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，平行試驗(yàn)3次,并使用SPSS 20.0軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析和方差分析，因素水平表見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表

表2 提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

根據(jù)極差分析與方差分析結(jié)果得出，各因素對(duì)風(fēng)味物質(zhì)提取的影響大小依次為：C>A>D>B，即酶比例>酶用量>超聲時(shí)間>pH。預(yù)測(cè)最佳提取工藝為A3B1C2D1，試驗(yàn)最佳提取工藝為A3B1C2D3，與預(yù)測(cè)值有差異，通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，預(yù)測(cè)組氨基酸含量為49.03 mg/g，試驗(yàn)組氨基酸含量為43.34 mg/g，故確定香菇提取最佳條件為A3B1C2D1，即：纖維素酶和中性蛋白酶比例為1∶3，酶總添加量2.75%，pH 5.0，超聲20 min，氨基酸含量達(dá)49.03 mg/g。

2.4 通江香菇調(diào)味料配方的優(yōu)化

2.4.1 通江香菇調(diào)味料的制備

取香菇粉1000 g，采用最佳提取工藝提取，于55 ℃減壓濃縮至稠膏狀，以干香菇量計(jì)，每1 g香菇提取液含干香菇2 g。將白砂糖、味精分別粉碎過(guò)6號(hào)篩，取一定量于研缽中，加入食鹽共研至混合均勻，得混合物1。將淀粉與麥芽糊精混勻，得混合物2。再按等量遞增法將混合物1和2混勻。取香菇稠膏，加入輔料混合物制得軟材，達(dá)到“輕握成團(tuán)，輕壓即散”的狀態(tài)，再擠壓過(guò)篩，45 ℃干燥，整粒。

2.4.2 通江香菇調(diào)味料配方的單因素與正交設(shè)計(jì)

為保證通江香菇調(diào)味料具有良好的顆粒性和溶解性，預(yù)試驗(yàn)確定取香菇稠膏12 g，麥芽糊精20 g，淀粉40 g。選擇影響滋味的3個(gè)因素，通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定參數(shù)取值范圍，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定單因素如下：白砂糖粉添加量4，6，8，10，12 g；味精添加量5，10，15，20 g；食鹽添加量2，5，8，11 g，考察各參數(shù)對(duì)調(diào)味料滋味的影響。依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)，并使用SPSS 20.0軟件對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析和方差分析，因素水平表見(jiàn)表4，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

表4 通江香菇調(diào)味料正交試驗(yàn)因素水平表

表5 通江香菇調(diào)味料正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 方差分析結(jié)果

根據(jù)極差分析及方差分析結(jié)果得出，3個(gè)因素感官評(píng)價(jià)影響的主次順序?yàn)椋篊>B>A，即食鹽>味精>白砂糖粉，味精、食鹽添加量對(duì)感官評(píng)價(jià)有顯著影響(P<0.05)，預(yù)測(cè)最佳配方為A3B2C3，試驗(yàn)最佳配方為A1B2C3，與預(yù)測(cè)值有差異，需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。按照預(yù)測(cè)組、試驗(yàn)組分別制作3批樣品，進(jìn)行感官評(píng)分，預(yù)測(cè)組平均得分為68.4，試驗(yàn)組平均得分為69.2，因此確定最優(yōu)配方為A1B2C3，即：香菇稠膏12 g，白砂糖10 g，味精10 g，食鹽8 g。

2.5 感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)產(chǎn)品香味、滋味、色澤及組織狀態(tài)設(shè)計(jì)感官評(píng)分表，香味25分，滋味35分，色澤10分，組織狀態(tài)10分，總分80分，感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表7。稱取通江香菇調(diào)味料約1 g，加水100 mL配成溶液，進(jìn)行感官評(píng)分，取平均值。受試者均為在校大學(xué)生，接受過(guò)感官評(píng)價(jià)相關(guān)培訓(xùn)，滿足感官評(píng)價(jià)要求，共計(jì)92人。

表7 通江香菇調(diào)味料感官評(píng)分表

2.6 質(zhì)量檢查

2.6.1 理化及衛(wèi)生指標(biāo)[5-8]

按最優(yōu)配方制作通江香菇調(diào)味料3批，混合，隨機(jī)取樣，參照SB/T 10484—2008《菇精調(diào)味料》所規(guī)定的方法及標(biāo)準(zhǔn)限量，對(duì)其干燥失重、氯化物、氨基酸態(tài)氮、呈味核苷酸二鈉、鉛含量進(jìn)行測(cè)定，平行測(cè)定3次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表8。結(jié)果顯示，本配方下制作得到的調(diào)味料，均符合SB/T 10484—2008《菇精調(diào)味料》項(xiàng)下的限量要求。

表8 理化及衛(wèi)生指標(biāo)檢查結(jié)果

2.6.1.1 干燥失重

參照GB/T 8967—2007《谷氨酸鈉(味精)》中的快速法測(cè)定樣品中易揮發(fā)性物質(zhì)的質(zhì)量。

2.6.1.2 氯化物

參照SB/T 10371—2003《雞精調(diào)味料》中氯化物的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

2.6.1.3 呈味核苷酸二鈉

參照SB/T 10371—2003《雞精調(diào)味料》中呈味核苷酸二鈉的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

2.6.1.4 氨基酸態(tài)氮

參照SB/T 10484—2008《菇精調(diào)味料》中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

2.6.1.5 鉛含量

參照GB/T 5009.12-2007《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鉛的測(cè)定》中石墨爐原子吸收光譜法對(duì)樣品中的鉛含量進(jìn)行測(cè)定。

2.6.2 粉體學(xué)性質(zhì)檢查[9,10]

按最優(yōu)配方制作通江香菇調(diào)味料3批，混合，隨機(jī)取樣，對(duì)其進(jìn)行粒度、成型率、休止角和引濕性的考察，結(jié)果見(jiàn)表9。結(jié)果顯示，本配方制作得到的調(diào)味料顆粒分布均勻，成型率達(dá)到90%，流動(dòng)性良好，稍具引濕性，但引濕性不強(qiáng)。

2.6.2.1 粒度分布與成型率

分別用2，3，4號(hào)分析篩對(duì)制粒后的調(diào)味料進(jìn)行篩分，以通過(guò)2，3號(hào)篩為合格品，計(jì)算合格品所占比例，即成型率。

表9 粉體學(xué)性質(zhì)檢查結(jié)果

2.6.2.2 休止角

采用固定漏斗法測(cè)定休止角，當(dāng)α≤30°時(shí)，認(rèn)為其流動(dòng)性良好。

2.6.2.3 引濕性

參照《中國(guó)藥典》2015版第四部藥物引濕性試驗(yàn)指導(dǎo)項(xiàng)下規(guī)定進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)引濕增重<0.2%時(shí)，無(wú)或幾乎無(wú)引濕性；當(dāng)0.2%<引濕增重<2%時(shí)，略有引濕性；當(dāng)2%<引濕增重<15%時(shí)，有引濕性；當(dāng)引濕增重>15%時(shí)，極具引濕性。

3 討論

3.1 提取工藝研究

食用菌中呈味物質(zhì)的提取方法包括熱水浸提、酶解提取、自溶提取、微波提取、超聲提取等，其中應(yīng)用最廣泛的是酶解法[11]，相比于單一酶酶解提取，雙酶法具有提取率高，時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)[12]，纖維素酶通過(guò)破壞細(xì)胞壁，增加胞內(nèi)物質(zhì)的溶出；中性蛋白酶從蛋白質(zhì)分子內(nèi)部切斷肽鏈，將蛋白質(zhì)水解成氨基酸，有利于呈味物質(zhì)的釋放[13]，使鮮味更濃郁，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高。超聲波具有空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，通過(guò)破壞細(xì)胞壁而促進(jìn)內(nèi)容物溶出，對(duì)香菇呈味物質(zhì)具有極佳的提取效果[14]。因此，本研究選擇超聲輔助酶解法，并采用纖維素酶與中性蛋白酶合用的方式，以提高通江香菇中呈味物質(zhì)的溶出度。

3.2 制備工藝研究

固體調(diào)味料的制備方法包括擠壓制粒法、攪拌法、沸騰法、噴霧干燥法等。文獻(xiàn)[15]對(duì)食用菌調(diào)味品造粒工藝進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)通過(guò)擠壓制粒法得到的顆粒，具有顆粒成型性高、流動(dòng)性好、吸濕率低的優(yōu)點(diǎn)。香菇水提液富含多糖，高溫容易破壞香菇多糖的結(jié)構(gòu)，而噴霧干燥溫度一般在150～200 ℃[16]，易造成營(yíng)養(yǎng)成分的損失。綜上考慮，本研究將香菇提取液減壓濃縮，再與輔料混合，最后擠壓制粒得到香菇調(diào)味料，使得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)最大限度保留，同時(shí)顆粒質(zhì)量較優(yōu)。

3.3 質(zhì)量檢查研究

固體調(diào)味料常見(jiàn)的質(zhì)量問(wèn)題除了食品安全隱患、指標(biāo)性成分不達(dá)標(biāo)等，還包括吸潮、結(jié)塊、變色等。對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)進(jìn)行整理，發(fā)現(xiàn)研究者對(duì)固體調(diào)味料的質(zhì)量檢查包括以下兩方面：①理化及衛(wèi)生指標(biāo)，包括呈味核苷酸二鈉、氨基酸態(tài)氮、干燥失重、氯化物、Pb含量等。呈味核苷酸二鈉、氨基酸態(tài)氮體現(xiàn)了調(diào)味料的呈味特性；Pb含量屬于食品安全性指標(biāo)，食品中應(yīng)嚴(yán)格控制其含量；②粉體學(xué)性質(zhì)考察，包括粒徑分布、成型率、流動(dòng)性和引濕性等。粉體學(xué)性質(zhì)旨在評(píng)價(jià)顆粒的性質(zhì)，與制粒工藝、產(chǎn)品質(zhì)量息息相關(guān)，休止角反映了顆粒的流動(dòng)性，吸濕性反映了顆粒吸附空氣中水蒸氣的能力，顆粒的大小、顆粒均勻度會(huì)直接影響其流動(dòng)性及吸濕性[17]。粉體學(xué)性質(zhì)在藥物制劑方面應(yīng)用廣泛，以粉體學(xué)性質(zhì)為指標(biāo)篩選干燥工藝、輔料類(lèi)型和制粒方法，有助于提高顆粒的制粒質(zhì)量，得到質(zhì)量穩(wěn)定、適宜于工業(yè)化生產(chǎn)的制備工藝[18-20]。食用菌固體調(diào)味料是調(diào)味料行業(yè)冉冉升起的新星，在研究初期，其質(zhì)量可控性更應(yīng)該受到重視，研究過(guò)程中不應(yīng)只以提取呈味物質(zhì)為主要目的，還應(yīng)考慮到最終產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，本研究在基礎(chǔ)配方的研究上，增加了調(diào)味料的質(zhì)量檢查，更為系統(tǒng)全面地進(jìn)行調(diào)味料的開(kāi)發(fā)研究，使調(diào)味料質(zhì)量更具可控性。

4 結(jié)論

超聲輔助提取能縮短酶解時(shí)間，纖維素酶與中性蛋白酶聯(lián)用可以提高呈味物質(zhì)的溶出度，試驗(yàn)結(jié)果表明最佳提取條件為：纖維素酶和中性蛋白酶比例為1∶3，酶總添加量2.75%，pH 5.0，超聲時(shí)間20 min，此提取條件下氨基酸含量為49.03 mg/g。通江香菇調(diào)味料最優(yōu)配方為：香菇稠膏12 g、味精10 g、食鹽8 g、白砂糖10 g、淀粉40 g、麥芽糊精20 g。按此配方工藝制作的香菇調(diào)味料為黃褐色，香菇特有風(fēng)味濃，味道鮮美。質(zhì)量檢查結(jié)果表明，采用擠壓制粒法制得的通江香菇調(diào)味料顆粒均勻，成型率高，流動(dòng)性良好，具有一定吸濕性，且理化及衛(wèi)生指標(biāo)達(dá)到《菇精調(diào)味料》項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。

香菇不僅滋味鮮美，且富含多種人體必需氨基酸，具有良好的營(yíng)養(yǎng)保健功能。通江香菇調(diào)味料的開(kāi)發(fā)，合理利用了通江香菇的優(yōu)質(zhì)資源，保留了香菇的鮮美滋味，不僅能增加菜肴的色、香、味，同時(shí)滿足了現(xiàn)代人對(duì)綠色健康食品的需求，是大健康產(chǎn)業(yè)下多元發(fā)展的體現(xiàn)。