侯建平 徐珂佳 王文義 張 琪 丁文金

河南平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 (河南 平頂山， 467000)

原發(fā)性肝癌簡(jiǎn)稱肝癌，是一種常見的消化道惡性腫瘤。它包括肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌和肝細(xì)胞癌-肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌混合型細(xì)胞癌。其中，肝細(xì)胞癌是肝癌中最為常見的病理類型[1]。2016年的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，每年約有50萬人死于肝細(xì)胞癌，死亡率居世界第四位；而中國(guó)是肝細(xì)胞癌的高發(fā)地區(qū)(占世界70%)，肝細(xì)胞癌已成為我國(guó)第三大惡性腫瘤，死亡率和發(fā)病率居高不下，嚴(yán)重威脅著我國(guó)人民的身體健康[2,3]。肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜，肝臟作為體內(nèi)最大的免疫器官，具有能夠?qū)愇?如腫瘤細(xì)胞)清除的免疫監(jiān)視功能，但仍存在腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，這可能與免疫逃逸有關(guān)。CD46和CD59在補(bǔ)體依賴性的細(xì)胞毒作用(CDC)中發(fā)揮著重要作用，而CDC是體液免疫的重要抗腫瘤機(jī)制之一，CD46和CD59的異常表達(dá)使腫瘤細(xì)胞免受攻擊是免疫逃逸系統(tǒng)的重要途徑[4]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒X蛋白結(jié)合蛋白(HBXIP)在肝癌中高表達(dá)，HBXIP能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移[5],同時(shí)發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中CD46的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，CD59可作為乙型肝炎病毒相關(guān)肝癌患者的靶點(diǎn)[6～9]，然而，HBXIP是否參與肝癌細(xì)胞的免疫逃逸過程的研究未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過體外細(xì)胞培養(yǎng)的方式初步探討HBXIP對(duì)肝癌細(xì)胞免疫逃逸作用的影響及可能的作用機(jī)制，以期為臨床逆轉(zhuǎn)肝癌的免疫逃逸提供新的線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 人正常肝細(xì)胞系HL-7702、肝癌細(xì)胞系HepG2、pSilencer-HBXIP、pSilencer、pcDNA3.1-HBXIP和pcDNA3.1質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存，胰蛋白酶、胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基和Lipofetamine2000購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司，HBXIP抗體、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體、CD59抗體、CD46抗體、pIκB抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物公司，臺(tái)盼藍(lán)和NF-κB抑制劑PDTC購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，人正常血清購(gòu)于艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 以RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、105U/L青霉素+100 mg/L鏈霉素)培養(yǎng)HepG2和HL-7702細(xì)胞，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2 免疫印跡法檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2和HL-7702細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，以每孔105個(gè)細(xì)胞平鋪于96孔細(xì)胞板上，待細(xì)胞貼壁后，加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，再加入RIPA細(xì)胞裂解液作用30 min，離心，上清液即為提取的總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。取60 μg變性總蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜，并在5%脫脂奶粉封閉液中封閉24 h。分別加入1000倍稀釋的HBXIP抗體、CD46抗體、CD59抗體和β-actin抗體，4 ℃孵育3 h，經(jīng)PBST洗膜后，再加入5000倍稀釋的二抗，37 ℃孵育2 h，洗膜后，以ECL顯色試劑盒顯影。β-actin作為內(nèi)參，以目的條帶灰度值/內(nèi)參灰度值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，將HepG2細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞隨機(jī)分為pSilencer-HBXIP組、pSilencer組、pcDNA3.1-HBXIP組和pcDNA3.1組。待細(xì)胞貼壁后，用PBS洗滌細(xì)胞，加入2 μg質(zhì)粒、5 μL Lipofetamine2000和400 μL OPTI-MEM培養(yǎng)液的混合溶液，將相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至相應(yīng)分組細(xì)胞中。培養(yǎng)6h后更換成不含抗生素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 臺(tái)盼藍(lán)染色 將轉(zhuǎn)染48 h后的HepG2細(xì)胞分為正常血清組和滅活血清組，PBS洗滌后，分別加入50 μL人正常血清和滅活血清，常溫下反應(yīng)1h后，緩慢吸盡血清，加入100 μL 4%臺(tái)盼藍(lán)溶液，常溫染色30 min后棄染液，洗滌后加入裂解液處理30min，取上清液，酶標(biāo)儀檢測(cè)590nm吸光值。其中，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以滅活血清(對(duì)照)為本底吸光度。

1.2.5 HBXIP對(duì)HepG2細(xì)胞中CD46、CD59和pIκB表達(dá)的檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染后48h的pSilencer-HBXIP組、pSilencer組、pcDNA3.1-HBXIP組和pcDNA3.1組細(xì)胞，參照1.2.2中的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)CD46、CD59和pIκBα表達(dá)情況。其中，一抗為1000倍稀釋的CD46、CD59和pIκBα抗體。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.2.6 NF-κB信號(hào)通路抑制劑PDTC作用后CD46、CD59的表達(dá)檢測(cè) 取生長(zhǎng)良好的pSilencer-HBXIP組和pcDNA3.1-HBXIP組細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入濃度為20 μmol/L NF-κB信號(hào)通路抑制劑PDTC 2 μL處理24h后，采用1.2.2中的方法檢測(cè)CD46、CD59的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果

2.1 HBXIP、CD46和CD59在肝癌細(xì)胞中的表達(dá) 見圖1、表1。

表1 HBXIP、CD46和CD59蛋白在肝癌細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量比較

細(xì)胞HBXIPCD46CD59HL-77020.46±0.050.89±0.080.82±0.06HepG20.92±0.112.21±0.261.98±0.12t值6.5948.40514.976P值0.0030.0010.000

2.2 HBXIP對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用影響 與pSilencer組相比，pSilencer-HBXIP組中HBXIP蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著降低(0.35±0.06vs0.83±0.08,t=3.469，P=0.009)；與其相反，pcDNA3.1-HBXIP組中HBXIP蛋白的相對(duì)表達(dá)量較pcDNA3.1組顯著升高(1.63±0.32vs0.88±0.05,t=5.420，P=0.001),見圖2。臺(tái)盼藍(lán)法檢測(cè)HBXIP對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用敏感性的影響結(jié)果見圖3。顯示，加入滅活血清后pSilencer組、pSilencer-HBXIP組、pcDNA3.1組和pcDNA3.1-HBXIP組細(xì)胞的吸光值(A590)分別為0.034±0.003、0.037±0.030、0.031±0.002和0.033±0.003，組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.081，P=0.968)；加入正常血清的各組細(xì)胞的A590分別為0.395±0.036、0.585±0.053、0.488±0.034和0.275±0.028，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.744,P=0.000)。pSilencer-HBXIP組細(xì)胞的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用明顯高于pSilencer組細(xì)胞(t=5.986，P=0.000)，而pcDNA3.1-HBXIP組細(xì)胞的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用顯著低于pcDNA3.1組(t=6.711，P=0.000)。結(jié)果表明，HBXIP參與了肝癌細(xì)胞中補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。

圖2 免疫印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后各組細(xì)胞HBXIP的表達(dá)圖

圖3 HBXIP對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用敏感性的影響圖：與pSilencer組相比，*P<0.05；與pcDNA3.1組相比，#P<0.05。

2.3 HBXIP對(duì)CD46和CD59蛋白表達(dá)的影響 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBXIP質(zhì)粒后，免疫印跡法檢測(cè)HepG2細(xì)胞中CD46和CD59蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果見圖4。與pSilencer組相比，pSilencer-HBXIP組中CD46、CD59蛋白的表達(dá)顯著受到抑制(0.49±0.05vs1.85±0.16,t=9.275，P=0.000；0.76±0.08vs2.26±0.32,t=6.947，P=0.000)，而pcDNA3.1-HBXIP組細(xì)胞中CD46、CD59蛋白的表達(dá)較pcDNA3.1組顯著上調(diào)(2.48±0.15vs1.76±0.28,t=4.910，P=0.001；2.64±0.35vs2.08±0.22,t=2.594，P=0.032)。

圖4 HBXIP對(duì)CD46、CD59蛋白表達(dá)的影響圖

2.4 HBXIP對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響 與pSilencer組相比，pSilencer-HBXIP組細(xì)胞IκB磷酸化水平降低(0.38±0.03vs0.68±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.911,P=0.001)。而與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-HBXIP組細(xì)胞IκB磷酸化水平升高(1.58±0.34vs0.71±0.08)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.314,P=0.013)。見圖5。

圖5 HBXIP表達(dá)對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響圖

2.5 HBXIP通過NF-κB信號(hào)通路調(diào)控CD46和CD59蛋白表達(dá) 為了探討HBXIP有無介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路調(diào)控CD46和CD59蛋白，以NF-κB信號(hào)通路抑制劑PDTC處理過表達(dá)和低表達(dá)HBXIP的HepG2細(xì)胞，結(jié)果見圖6和表2。PDTC處理后，pSilencer-HBXIP+抑制劑組和pcDNA3.1-HBXIP+抑制劑組細(xì)胞中CD46和CD59蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)。

圖6 PDTC對(duì)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞CD46、CD59蛋白表達(dá)的影響圖

表2 PDTC對(duì)CD46和CD59蛋白表達(dá)的影響比較

與pSilence-HBXIP組相比，*P<0.05；與pcDNA3.1-HBXIP組相比，#P<0.05

3 討論

HBXIP是一種最早從肝癌 HepG2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)由91個(gè)氨基酸編碼的細(xì)胞組成型蛋白，可與乙型肝炎病毒X蛋白的C末端特異性結(jié)合，改變乙型肝炎病毒X蛋白的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)乙型肝炎病毒復(fù)制周期[9，10]。有研究報(bào)道，HBXIP可通過調(diào)節(jié)E2F1表達(dá)，激活NF-κB抑制miR-509-3p表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)SCG3表達(dá)來發(fā)揮促肝癌細(xì)胞增殖的作用[11]；并且，HBXIP還能夠通過抑制阿霉素誘導(dǎo)的胱天蛋白酶家族關(guān)鍵因子的活性，抑制阿霉素誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡[12]?？梢姡琀BXIP在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮致癌基因的作用。補(bǔ)體系統(tǒng)可通過激活抗原抗體復(fù)合物和外來細(xì)胞途徑發(fā)揮溶解外來細(xì)胞的作用，在免疫反應(yīng)中扮演著重要角色；膜結(jié)合補(bǔ)體蛋白在維持補(bǔ)體的激活和抑制平衡中具有重要作用，CD46和CD59是腫瘤免疫研究較多的膜結(jié)合性的補(bǔ)體蛋白，CD46和CD59在腫瘤表面呈現(xiàn)高表達(dá)，抑制了補(bǔ)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的溶解作用，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避免疫攻擊[13～16]。有研究發(fā)現(xiàn)，HBXIP和CD46在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，CD59與乙肝病毒相關(guān)的肝癌的發(fā)展密切相關(guān)[5～8]，因此推測(cè)HBXIP可能通過調(diào)節(jié)CD46和CD59的表達(dá)，進(jìn)而參與了肝癌細(xì)胞的免疫逃逸過程。有報(bào)道指出，HBXIP通過激活ERK1/2/NF-κB信號(hào)通路上調(diào)膜結(jié)合補(bǔ)體蛋白CD46、CD55和CD59的表達(dá)，降低乳腺癌細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用的敏感性，發(fā)揮乳腺癌細(xì)胞的免疫逃逸作用[15]。然而，目前關(guān)于HBXIP對(duì)肝癌中的免疫逃逸作用的研究未見報(bào)道。

本研究以肝癌HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，通過免疫印跡法檢測(cè)HBXIP、CD46和CD59三種蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBXIP、CD46和CD59在HepG2細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá)，HBXIP可能與CD46和CD59的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)。為了探討HBXIP是否參與肝癌細(xì)胞的免疫逃逸過程，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過表達(dá)和低表達(dá)HBXIP質(zhì)粒，觀察其對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒細(xì)胞相比，過表達(dá)HBXIP的HepG2細(xì)胞的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用顯著降低，而低表達(dá)HBXIP的HepG2細(xì)胞則呈現(xiàn)出相反的效果。結(jié)果提示，HBXIP參與了肝癌細(xì)胞中補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。進(jìn)一步驗(yàn)證HBXIP與CD46和CD59的表達(dá)相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)HBXIP能夠抑制CD46和CD59的表達(dá)，而過表達(dá)HBXIP則促進(jìn)其表達(dá)。結(jié)果提示，HBXIP可能通過上調(diào)膜結(jié)合補(bǔ)體蛋白CD46和CD59的表達(dá)使肝癌細(xì)胞逃避了免疫系統(tǒng)的攻擊。

NF-κB是一種重要的快反應(yīng)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下，存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，會(huì)使抑制亞單位IκB磷酸化，IκB會(huì)從三聚體p50-p65-IκB上解離，使二聚體p50/p65表現(xiàn)出NF-κB活性，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[17，18]。NF-κB通過調(diào)控細(xì)胞因子、炎癥因子和免疫相關(guān)受體等多種基因的表達(dá)，參與肝癌形成、炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病等生理過程，NF-κB信號(hào)通路是肝臟免疫性疾病的重要通路。王鳳澤等[19]人指出，HBXIP能夠通過激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。Cui W等人[15]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)HBXIP可通過激活NF-κB信號(hào)通路影響CD46和CD59蛋白的表達(dá)。目前，關(guān)于NF-κB信號(hào)通路有無參與肝癌細(xì)胞免疫逃逸的作用機(jī)制未見報(bào)道。為了進(jìn)一步探討HBXIP在肝癌免疫逃逸中的作用機(jī)制，本研究通過檢測(cè)HBXIP對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響，并通過抑制NF-κB信號(hào)通路活性觀察CD46和CD59蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中HBXIP對(duì)NF-κB信號(hào)通路有顯著的調(diào)節(jié)作用，抑制NF-κB信號(hào)通路的活性后，CD46和CD59蛋白的表達(dá)均顯著降低。結(jié)果提示，HBXIP可能通過激活NF-κB信號(hào)通路上調(diào)CD46和CD59的表達(dá)，從而在肝癌中發(fā)揮免疫逃逸作用。

綜上所述，HBXIP在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，參與了補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，在肝癌細(xì)胞的免疫逃逸過程中發(fā)揮了積極作用，其作用機(jī)制可能與HBXIP激活NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而上調(diào)補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46和CD59的表達(dá)有關(guān)。該研究豐富了肝癌細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制，為臨床逆轉(zhuǎn)肝癌的免疫逃逸提供新的靶點(diǎn)和依據(jù)。