折米娜，望詩琪，趙慧君，郭壯,2，廖華，張振東*

(1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.恩施市公共檢驗(yàn)檢測中心，湖北 恩施 445000；3.恩施市農(nóng)業(yè)局，湖北 恩施 445000)

酸菜，是一種流行于東北、四川、貴州和云南等地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品[1]，通常以白菜或青菜為主要原料，經(jīng)微生物自然發(fā)酵而成。由于制作環(huán)境相對開放，因而酸菜中微生物種類較為豐富[2]，且研究表明不同地區(qū)酸菜中乳酸菌的群系存在較大差異。東北地區(qū)自然發(fā)酵酸菜中的乳酸菌主要為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuter)和米酒乳桿菌(Lactobacillussakei)[3]，而云南地區(qū)自然發(fā)酵酸菜中的乳酸菌主要為植物乳桿菌(Lactobacilllusplantarum)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)和腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)[4]，亦有報道指出四川泡菜中的優(yōu)勢菌群為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)和耐乙醇片球菌(Pediococcusethanoliduran)[5]。作為秦巴山區(qū)生物多樣性保育重要生態(tài)功能區(qū)，恩施土家族苗族自治州亦有制作和食用酸菜的習(xí)俗，然而目前關(guān)于該地區(qū)酸菜中微生物多樣性的研究報道尚少。

分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究，其中Illumina Miseq第二代高通量測序技術(shù)是直接將樣品的宏基因組擴(kuò)增后進(jìn)行測序，從而獲得不同環(huán)境下對應(yīng)微生物的群落結(jié)構(gòu)，不僅可以檢測到低豐度的微生物而且結(jié)果準(zhǔn)確可靠[6]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)結(jié)合變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)是一種能快速、準(zhǔn)確和高效鑒定自然環(huán)境或人工環(huán)境中微生物的種類，進(jìn)而反映微生物群落結(jié)構(gòu)組成的分析技術(shù)[7]。Illumina Miseq技術(shù)和PCR-DGGE技術(shù)均可以克服傳統(tǒng)純培養(yǎng)微生物學(xué)手段耗時長和工作量大等缺點(diǎn)，二者被廣泛應(yīng)用于腸道微生物[8,9]、環(huán)境微生物[10,11]和食品微生物等領(lǐng)域[12,13]。

本研究以恩施土家族苗族自治州酸菜水為研究對象，采用Miseq高通量測序技術(shù)結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)對細(xì)菌和乳酸菌多樣性進(jìn)行了解析，并利用傳統(tǒng)微生物學(xué)手段對酸菜水中的乳酸菌進(jìn)行了分離鑒定。通過本研究的開展，以期為恩施地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的產(chǎn)業(yè)化提供數(shù)據(jù)支撐，同時為后續(xù)發(fā)酵食品中乳酸菌的開發(fā)提供菌株支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：采購于恩施市土橋壩菜市場。

試劑：三羥甲基氨基甲烷、乙酸、乙二胺四乙酸、聚丙烯酰胺、N,N-亞甲基二丙烯酰胺、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、乙酸鈉、酵母粉、檸檬酸二銨、磷酸氫二鉀、七水合硫酸鎂、一水合硫酸錳和吐溫80：均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D5625-01 DNA提取試劑盒：美國OMEGA公司；DNA Marker(FERMENTAS)和PCR清潔試劑盒(AXYGEN)：京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；2PCR×mix：南京諾唯贊生物科技有限公司；rTaq、dNTPmix、pMD18-T vector：大連寶生物技術(shù)有限公司(TaKaRa)，由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成；PCR引物合成和測序：由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

Miseq PE300高通量測序平臺 美國Illumina公司；R920機(jī)架式服務(wù)器 美國DELL公司；CT15RE冷凍離心機(jī) 日本HITACHI公司；Veriti 96-well thermal cycler PCR儀 美國AB 公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計 美國Thermo Fisher公司；DCodeTMSystem 美國Bio Red公司；DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠；FluorChem FC3 美國FluorChem公司；Bio-5000 plus掃描儀 上海中晶科技有限公司；DG250厭氧工作站 英國DWS公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品總DNA提取與檢測

采用OMEGA D5625-01試劑盒提取3個酸菜水樣品中的總DNA，提取成功后用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測并測定其DNA的濃度。

1.3.2 樣品細(xì)菌16S rRNA PCR擴(kuò)增及Miseq高通量測序

擴(kuò)增體系：4 μL 5×PCR緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTP Mix，0.8 μL 5 μmol/L正向引物，0.8 μL 5 μmol/L反向引物，0.4 μL 5 U/μL Taq酶，10 ng DNA模板，ddH2O補(bǔ)充至20 μL。其中引物為338F/806R。

擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后將濃度稀釋至100 nmol/L，寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Miseq高通量測序。

1.3.3 序列拼接及質(zhì)量控制

下機(jī)序列參照王玉榮等[14]和蔡宏宇等[15]的方法進(jìn)行質(zhì)控，同時使用QIIME(V1.7.0)分析平臺進(jìn)行生物信息學(xué)分析。使用PyNAST軟件將所有的序列對齊后，采用兩步UCLUST算法分別以100%和97%的相似度進(jìn)行序列劃分并建立分類操作單元(operational taxonomic units，OTU)，從每個OTU中選取1條代表性序列，使用RDP(ribosomal database project)和Greengenes數(shù)據(jù)庫對序列進(jìn)行同源性比對，通過對數(shù)據(jù)的整理確定各樣品種屬分類學(xué)地位，進(jìn)而對酸菜水中的Chao 1指數(shù)和Shannona指數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行計算。將在3個樣品中均存在的OTU定義為核心OTU。

1.3.4 基于PCR-DGGE技術(shù)酸菜水中乳酸桿菌多樣性解析

將1.3.1中DNA濃度調(diào)整一致后作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。乳桿菌16S rDNA基因片段PCR擴(kuò)增所用的引物為：正向引物為LacF-GC(5'-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGC CCG GGG GCA CCG GGG GCT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3')，反向引物為LacR(5'-GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C-3')。PCR擴(kuò)增體系為2.5 μL 10×PCR Buffer(含Mg2+)，2 μL dNTP(2.5 mol/L)，0.5 μL正向引物(10 mmol/L)，0.5 μL負(fù)向引物(10 mmol/L)，0.5 μL rTaq(5 U/μL)，1 μL DNA模板，ddH2O補(bǔ)充至25 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 4 min預(yù)變性，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)，最后在72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂使用變性劑線性梯度為35%～52%，濃度為8%的聚丙烯酰胺(40%丙烯酰胺/N，N-亞甲基二丙烯酰胺)對樣品DNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳。DGGE條件：點(diǎn)樣量為10 μL，電泳液為0.5 TAE，電泳溫度為60 ℃，電壓與時間為120 V，80 min，然后80 V，13 h。電泳結(jié)束后，對DGGE膠進(jìn)行硝酸銀染色[16]，使用掃描儀對凝膠電泳圖進(jìn)行觀察拍照，并對優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠并回收?；厥盏臈l帶用不含GC夾子的LacF和LacR引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及條件與上述方法相同。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行清潔純化，并與PMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10中，經(jīng)單克隆鑒定為陽性后送往武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測序。

將測序結(jié)果除去兩端載體的序列，然后使用BioEdit軟件將序列進(jìn)行拼接。拼接結(jié)果在NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中比對查詢，找出相似度高的相似序列用MEGA 5.0軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 酸菜水中乳酸菌的分離與鑒定

將酸菜水樣品進(jìn)行倍比稀釋(稀釋度為10-5，10-6，10-7)，涂布于含有1.5% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基上，置于厭氧工作站在37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取有透明圈的菌落進(jìn)行劃線純化，并進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)及菌株的保藏。用CTAB法提取各純化菌株的DNA[17]，使用通用引物27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')和1495R(5'-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3')進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增體系：2.5 μL 10×PCR Buffer(含Mg2+)，2 μL dNTP(2.5 mol/L)，0.5 μL 27 f(10 mmol/L)，0.5 μL 1495 r(10 mmol/L)，0.5 μL rTaq(5 U/μL)，0.5 μL DNA模板，ddH2O補(bǔ)充至25 μL。

PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 4 min預(yù)變性，95 ℃變性1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物2.5 μL用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測合格后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行清潔純化，并與PMD18-T載體連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10中，經(jīng)單克隆鑒定為陽性后送往武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果分析同1.3.5。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過Origin 8.5軟件進(jìn)行各項(xiàng)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計并作圖，熱圖由Matlab 2010b繪制，系統(tǒng)發(fā)育樹由BioEdit軟件和MEGA 5.0軟件共同繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

本研究首先將3個恩施地區(qū)酸菜水進(jìn)行16S rRNA測序，其結(jié)果及各分類地位數(shù)量見表1。

表1 樣品16S rRNA測序情況及各分類地位數(shù)量

注：計算每個樣品Chao 1和Shannon指數(shù)時，樣品的測序量均為30510條序列。

本研究采集的3個酸菜水樣品共產(chǎn)生了117276條16S rRNA序列。根據(jù)100%的相似性進(jìn)行序列劃分共得到60342條代表性序列，根據(jù)序列的97%相似性進(jìn)行OTU劃分后，共得到4473個OTU，每個樣品平均1419個。由表1可知，SCS02樣品具有最大的細(xì)菌物種豐度，其Chao 1指數(shù)為1013，而SCS03樣品細(xì)菌多樣性最高，其Shannon指數(shù)為6.20。

2.2 基于不同分類地位酸菜水樣品核心細(xì)菌菌群相對含量分析

納入本研究的序列被鑒定為7個門、15個綱、29個目、38個科和58個屬，其中只有0.37%的序列不能鑒定到屬水平。本研究的3個酸菜水樣品中平均相對含量>1%的細(xì)菌門分別為硬壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，其相對含量分別為97.78%和1.96%。值得一提的是，3個樣品中隸屬于硬壁菌門(Firmicutes)的細(xì)菌相對含量分別為98.10%，95.28%，99.95%?；趯偎?個酸菜水樣品中優(yōu)勢細(xì)菌的相對含量見圖1。

圖1 酸菜水中優(yōu)勢細(xì)菌屬相對含量的比較分析

由圖1可知，優(yōu)勢細(xì)菌屬分別為隸屬于硬壁菌門(Firmicutes)的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和片球菌屬(Pediococcus)，其平均相對含量分別為76.25%和15.80%。通過采用454焦磷酸測序技術(shù)，李欣蔚等對16 份東北傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸菜汁樣品中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析，研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為其優(yōu)勢細(xì)菌門，而乳桿菌屬(Lactobacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)和明串珠菌屬(Leuconostoc)為其優(yōu)勢菌屬[18]。利用構(gòu)建16S rRNA基因文庫的方法，曹碧璇等對遼寧地區(qū)農(nóng)家自然發(fā)酵酸菜液中的微生物多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)和枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)是酸菜發(fā)酵液中的優(yōu)勢菌[19]。利用Illumina高通量測序技術(shù)，佟婷婷對四川農(nóng)家泡菜中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)四川地區(qū)泡菜中的優(yōu)勢菌是乳桿菌屬(Lactobacillus)，且含量達(dá)到80%～85%[20]。利用PCR-DGGE技術(shù)，烏日娜對東北地區(qū)發(fā)酵酸菜中的微生物多樣性進(jìn)行解析時發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬(Lactobacillus)為其中的優(yōu)勢細(xì)菌屬[21]。由此可見，雖然不同地區(qū)制作酸菜的工藝和原料不同，但是乳酸桿菌均為其優(yōu)勢細(xì)菌屬。

本研究進(jìn)一步統(tǒng)計了OTU在3個樣品中出現(xiàn)的次數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)1次和2次的OTU分別為3759個和530個，分別占OTU總數(shù)的84.04%和11.85%，所包含的序列數(shù)為8946條和25678條。同時核心OTU為184個，占OTU總數(shù)的4.11%，所包含的序列數(shù)為82437條，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)在184個核心OTU之中有11個OTU的相對含量大于1%。本研究進(jìn)一步對11個核心OTU在3個酸菜水樣品中的相對含量進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖2。

圖2 平均相對含量大于1.0%的核心OTU在酸菜水樣品中相對含量的熱圖

由圖2可知，在11個核心OTU中，10個隸屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，只有OTU3578隸屬于片球菌屬(Pediococcus)，11個核心OTU的累計相對含量達(dá)47.68%。部分OTU在3個樣品中的相對含量差異較大，其中OTU3578在SCS01和SCS02中的相對含量分別為5.24%和5.69%，而在SCS03中的相對含量為27.17%；OTU1679在SCS01和SCS02中的相對含量分別為0.77%和0.17%，而在SCS03中的相對含量為19.27%。

2.3 酸菜水中乳桿菌DGGE圖譜及系統(tǒng)發(fā)育分析

在對酸菜水樣品進(jìn)行Miseq高通量測序后，本研究進(jìn)一步使用PCR-DGGE技術(shù)對3個樣品乳酸桿菌屬的多樣性進(jìn)行了分析。由于不同樣品乳酸桿菌的群落結(jié)構(gòu)不同，在變性梯度凝膠電泳后會分離出數(shù)目不等的條帶。分離出的條帶數(shù)目越多，說明樣品微生物多樣性越豐富，同時各條帶的亮度在一定程度上亦能說明微生物的豐度存在差異[22]。酸菜水中乳酸桿菌的PCR-DGGE電泳圖見圖3。

圖3 酸菜水中乳酸桿菌PCR-DGGE電泳圖

注：01，02，03分別為SCS01，SCS02，SCS03。

由圖3可知，指紋圖譜中共有8條條帶較為明亮，其中條帶3和條帶4在所有樣品中均存在，但亮度不一致；條帶6和條帶8存在于SCS01和SCS02中，亮度亦不一致；條帶1僅存在于SCS02樣品中，條帶2僅存在于SCS01樣品中，條帶5和條帶7僅存在于SCS03樣品中。由此可見，不同酸菜樣品間乳酸桿菌的多樣性亦存在一定的差異。本研究進(jìn)一步對各條帶進(jìn)行了序列分析，結(jié)果見表2。

表2 酸菜水中乳桿菌DGGE條帶比對結(jié)果

由表2可知，8個特異性條帶均屬于乳酸桿菌屬，且各條帶序列與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中已知16S rDNA序列都具有較高的相似度。其中條帶2，3，8為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，條帶4和條帶5為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)，條帶1為面包乳桿菌(Lactobacilluspanis)，條帶6為短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)，條帶7為Lactobacillusrennini。本研究進(jìn)一步將鑒定結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的模式菌進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果見圖4。

圖4 系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖4可知，系統(tǒng)發(fā)育樹分為兩大支，條帶1，2，3，4，5，6，8均在同一分支上，這表明上述菌株的親緣關(guān)系較近，而條帶7在另一分支上，這可能是由于該菌株的進(jìn)化關(guān)系較其他菌株較遠(yuǎn)導(dǎo)致的。武俊瑞等[23]利用PCR-DGGE技術(shù)對東北自然發(fā)酵酸菜中乳酸菌的多樣性進(jìn)行了分析，在5 份酸菜中共鑒定出9 株乳酸菌，其中優(yōu)勢乳酸菌是植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)，而周金明等[24]利用PCR-DGGE技術(shù)對不同發(fā)酵時期酸菜發(fā)酵液微生物菌群進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)是酸菜發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌，其研究的結(jié)果與本研究相同。

2.4 酸菜水中乳酸菌分離鑒定結(jié)果

本研究進(jìn)一步使用含有1.5% CaCO3的MRS培養(yǎng)基對3個酸菜水樣品進(jìn)行了乳酸菌的分離鑒定，測序比對結(jié)果見表3。

表3 酸菜水中16S rDNA基因序列比對結(jié)果

由表3可知，從3個樣品中共分離出8株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、2株短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、2株發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)和1株棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformis)，這進(jìn)一步證實(shí)恩施地區(qū)酸菜水中的乳酸菌具有較高的多樣性。

3 結(jié)論

本研究采用Miseq高通量測序技術(shù)與PCR-DGGE技術(shù)相結(jié)合的方法對恩施地區(qū)酸菜水中的微生物多樣性進(jìn)行了解析，同時利用傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)方法分離乳酸菌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸菜水樣品中的細(xì)菌微生物主要是隸屬于硬壁菌門的乳桿菌屬和片球菌屬，其中乳酸桿菌屬是優(yōu)勢屬，經(jīng)PCR-DGGE和純培養(yǎng)的方式進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)酸菜水中的優(yōu)勢乳酸菌為植物乳桿菌。通過本研究可知傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中蘊(yùn)含著豐富的微生物資源，其中以乳酸菌最為豐富，而乳酸菌作為一種益生菌被廣泛應(yīng)用于各類食品加工中，這為傳統(tǒng)發(fā)酵食品的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了有利條件。