周芳，索化夷

(1.西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.食品科學(xué)與工程國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(西南大學(xué))，重慶 400715)

豆豉是中國傳統(tǒng)發(fā)酵大豆食品之一，可分為毛霉型、曲霉型和細(xì)菌型等[1]。其中具有濃郁醬香和豉香的毛霉型豆豉是一種極具地區(qū)特色的豆豉，深受消費(fèi)者喜愛，永川豆豉是其代表產(chǎn)品。

近年來，心腦血管疾病和動脈硬化等慢性疾病發(fā)生率逐年增加，自由基引起的機(jī)體氧化損傷被認(rèn)為是主要原因。增加飲食中天然抗氧化物質(zhì)的攝入量能較好抵御自由基侵害并預(yù)防慢性疾病[2，3]。研究發(fā)現(xiàn)豆豉具有抗氧化、降血壓、降血脂等保健功能。豆豉具有良好的抗氧化能力，在其發(fā)酵過程中大豆異黃酮構(gòu)型轉(zhuǎn)變、蛋白質(zhì)降解、類黑精生成等變化在不同程度上提高了豆豉的抗氧化活性[4，5]，但豆豉抗氧化活性增加的主要原因還存在爭議，宋永生等人研究認(rèn)為異黃酮的轉(zhuǎn)化增加了豆豉的抗氧化活性[6]。而Sheih等人研究表明Tempe抗氧化活性只有1/3與異黃酮轉(zhuǎn)化有關(guān)，其余2/3由蛋白質(zhì)降解引起[7]。Fan Junfeng研究認(rèn)為蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的抗氧化肽和氨基酸使豆豉具有清除DPPH和ATBS能力[8]。大豆中的大豆蛋白經(jīng)微生物和酶的作用降解為肽、游離氨基酸等，這些物質(zhì)能清除自由基，抗脂質(zhì)過氧化，還影響類黑精的生成[9]。類黑精是發(fā)酵過程中美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物，具有消除羥自由基、抑制亞硝胺合成的能力[10]。本文通過測定不同發(fā)酵期永川豆豉樣品的·OH，NO2-，O2-清除率并與異黃酮及其不同構(gòu)型含量、氨基酸態(tài)氮含量、色差值進(jìn)行Person相關(guān)性分析，進(jìn)一步明確影響永川豆豉抗氧化活性的主要因素。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品為永川豆豉食品有限公司經(jīng)天然制曲發(fā)酵，取自處于不同發(fā)酵階段的永川毛霉型豆豉。原料大豆產(chǎn)地為中國吉林省。永川豆豉生產(chǎn)工藝：大豆篩選→浸泡→瀝干→常壓蒸料→冷卻→自然發(fā)酵制曲→翻曲→拌和(食鹽、醪糟、白酒)→入罐發(fā)酵后熟→成品。

S1～S16分別代表了豆豉樣品的不同加工時期，詳見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)樣品代號

無水乙醇、鄰苯三酚、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、無水對苯氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、檸檬酸、磷酸二氫鈉、濃鹽酸:分析純，成都市科龍化工試劑廠；甲醇:色譜純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

H-2050R臺式高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ELPHA 1-4真空冷凍干燥機(jī) 德國Marin Christ公司；KQ-100B超聲波振蕩器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 豆豉抗氧化物質(zhì)的提取

取不同加工時期收集的豆豉樣品S1～S16，真空冷凍干燥后將樣品研磨成粉末，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＞_稱取(1.000±0.050) g樣品粉末，加入10 mol/L體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇，室溫下于超聲波振蕩器中振蕩提取2 h，高速冷凍離心機(jī)離心，取上清液再次離心，離心條件：4000 r/min，離心20 min，最后取上清液，置于4 ℃保存?zhèn)溆肹11]。

1.3.2 羥自由基(·OH)清除率實(shí)驗(yàn)

采用水楊酸比色法測定羥基自由基清除能力[12]。取樣品溶液S1～S16,按1∶10進(jìn)行稀釋。取若干支25 mL的比色管，分別加入1 mL 9 mmol/L FeSO4、2 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，再依次加入2 mL稀釋后的S1～S16提取液，最后加入2 mL 8.8 mmol/L H2O2，混勻后于室溫下反應(yīng)1 h。以蒸餾水調(diào)零，在510 nm處測定樣品的吸光度(A)。用2 mL蒸餾水分別代替體系中的樣品稀釋液和8.8 mmol/L H2O2測定空白對照吸光度(A0)及樣品本底吸光度(A1)，按下式計(jì)算其清除率。

清除率=[A0-(A-A1)]/A0×100%。

1.3.3 亞硝酸鹽(NO2-)清除率實(shí)驗(yàn)

取豆豉S1～S16提取液2 mL于25 mL 容量瓶中，加入5 μg/mL 的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液3 mL，加入檸檬酸-磷酸緩沖溶液(pH 3.0)5 mL，37 ℃下反應(yīng)30 min，立即加入2 mL 0.4 g/L對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min 后，加入1 mL 0.2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液，加蒸餾水至刻度，混勻，靜置15 min后在544 nm 處測定樣品吸光度(A)。用蒸餾水分別代替樣品提取液和顯色劑測定空白對照吸光度(A0)和樣品本底吸光度(A1)。按下式計(jì)算NO2-的清除率[13]。

清除率=[A0-(A-A1)]/A0×100%。

1.3.4 超氧陰離子(O2-)清除率實(shí)驗(yàn)

采用鄰苯三酚自氧化法測定O2-清除率[14]。在25 mL的比色管中分別加入3 mL Tris-HCl 緩沖液(pH 8.2)，0.1 mL 豆豉S1～S16提取液，(25±0.5) ℃水浴平衡20 min 后，加入0.3 mL 7 mmol/L 的鄰苯三酚反應(yīng)4 min，加入1 mL 10 mol/L HCl 終止反應(yīng)，在420 nm處測吸光度(A)。用0.1 mL蒸餾水和0.3 mL蒸餾水分別代替樣品提取液7 mmol/L 的鄰苯三酚測定空白對照吸光度(A0)及樣品本底吸光度(A1)，按下式計(jì)算清除率。

清除率=[A0-(A-A1)]/A0×100%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用軟件Excel 2010和SPSS 20進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，每個處理重復(fù)3次，結(jié)果以平均值表示。異黃酮及其不同構(gòu)型含量、氨基酸態(tài)氮含量、色差值L*與自由基清除率的相關(guān)性采用Person相關(guān)性分析，雙側(cè)檢驗(yàn)，α=0.01為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵期豆豉醇提物對自由基的清除作用

圖1 樣品發(fā)酵過程中清除率變化

由圖1可知，未發(fā)酵的大豆原料S1對自由基也存在一定的消除作用，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，樣品S1～S16對自由基的清除率逐漸增強(qiáng)。樣品對不同自由基的清除率之間存在著差異，但是隨著發(fā)酵時間的變化趨勢大致相同。在預(yù)處理階段(S1～S3)·OH，O2-兩種自由基清除率出現(xiàn)小幅度降低，這與Berghofer等研究的蒸煮降低抗氧化能力結(jié)果一致[15]。

表2 樣品發(fā)酵過程中自由基清除率變化

續(xù) 表

由表2可知，在發(fā)酵終點(diǎn)時樣品S16對·OH，NO2-，O2-的清除率達(dá)到最大，分別為75.15%，87.09%，53.41%，是普通大豆樣品S1清除率的3.39，16.8，3.97倍，這與徐聰聰?shù)热搜芯康陌l(fā)酵豆粕的·OH清除率(84.65%)、O2-清除率(45.49%)相差不大[16]，說明發(fā)酵處理可以提高大豆的抗氧化活性，且主要發(fā)生在后發(fā)酵時期。

2.2 不同物質(zhì)與抗氧化活性之間的相關(guān)性分析

發(fā)酵過程中不同時間點(diǎn)異黃酮和氨基酸態(tài)氮含量以及色差值L*含量變化見表3[17，18]。發(fā)酵前后異黃酮總量基本不變，但構(gòu)型在預(yù)處理和制曲階段發(fā)生明顯轉(zhuǎn)變，苷元型異黃酮占比由起始的3.2%上升到了95.7%，在發(fā)酵后期趨于穩(wěn)定。氨基酸態(tài)氮含量隨著蛋白質(zhì)發(fā)生降解而逐漸增加，在一定程度上代表蛋白質(zhì)的降解程度。色差值L*的數(shù)值減小表示豆豉色澤在不斷向黑色轉(zhuǎn)變，這種顏色變化源于美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的類黑精。

表3 豆豉發(fā)酵過程中抗氧化物質(zhì)變化

異黃酮含量和氨基酸態(tài)氮含量與自由基清除率之間的Person相關(guān)性分析結(jié)果見表4，苷元型異黃酮含量和氨基酸態(tài)氮含量與·OH，NO2-，O2-的清除率均呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，且相關(guān)系數(shù)分別為0.702，0.661，0.704，0.929，0.843，0.901；糖苷型異黃酮含量和色差值L*與·OH，NO2-，O2-的清除率均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，且相關(guān)系數(shù)分別為-0.835，-0.748，-0.801，-0.830，-0.829，-0.833。這說明異黃酮構(gòu)型轉(zhuǎn)變、蛋白質(zhì)降解以及類黑精的生成對豆豉抗氧化活性的變化都有顯著影響，但是由相關(guān)系數(shù)比較而言，蛋白質(zhì)降解與抗氧化活性的關(guān)系更為密切。同時3種自由基清除率之間也存在顯著相關(guān)性，這也進(jìn)一步證明豆豉對3種不同自由基清除率隨發(fā)酵時間變化趨勢一致。

表4 抗氧化物質(zhì)與自由基清除率的Person相關(guān)性

續(xù) 表

注：“*”表示在 0.05 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)；“**”表示在 0.01 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

圖2 苷元型異黃酮(A)氨基酸態(tài)氮(B)色差值L*(C)對自由基清除率的影響

由圖2可知，一開始隨著苷元型異黃酮含量的增加，自由基清除率變化甚微，但當(dāng)苷元型異黃酮含量增加到1500 mg/kg左右時自由基清除率急速增加。而隨著氨基酸態(tài)氮含量的增加，自由基清除率呈階段性增加。綜合表1～表3觀察，在預(yù)處理(S1～S3)和制曲階段(S4～S9)自由基清除率和氨基酸態(tài)氮含量的變化波動較小，進(jìn)入后發(fā)酵階段(S10～S16)迅速增加，在發(fā)酵即將結(jié)束時氨基酸態(tài)氮含量有所下降；隨著發(fā)酵作用的進(jìn)行，類黑精的生成致使豆豉顏色不斷向黑色轉(zhuǎn)變，色差值L*逐漸減小，與·OH，NO2-，O2-的清除率呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，而類黑精的生成有賴于蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的游離氨基酸，這解釋了在發(fā)酵后期氨基酸態(tài)氮含量有所下降而豆豉對自由基清除率持續(xù)上升的原因[19，20]。

3 結(jié)論

發(fā)酵處理可以提高大豆的抗氧化活性。豆豉成品S16對·OH，NO2-，O2-的清除率分別為75.15%，87.09%，53.41%，分別是普通大豆S1清除率22.19%，5.17%，13.44%的3.39，16.8，3.97倍。

豆豉對·OH，NO2-，O2-的清除率隨發(fā)酵時間的變化趨勢一致，且在后發(fā)酵階段急劇增加。

蛋白質(zhì)降解是引起豆豉抗氧化活性增加的主要原因。經(jīng)Person相關(guān)性分析，苷元型異黃酮和氨基酸態(tài)氮含量對豆豉抗氧化活性變化有顯著性影響，但是較相關(guān)系數(shù)來說，氨基酸態(tài)氮含量對抗氧化活性變化的影響更顯著。