魏 英，陳琴華，武 倫，袁方均，周文波*

0 引言

肝細(xì)胞癌(HCC)是全球第5大常見和第3大致命腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類健康。目前全球每年有超過50萬(wàn)人被診斷為肝細(xì)胞癌，其發(fā)病率逐年增加[1]。盡管目前診斷和治療技術(shù)有所改進(jìn)，但HCC的5年生存率仍然較低，約為15%(偏遠(yuǎn)地區(qū)僅為2%)[2-3]。HCC為典型的炎癥相關(guān)性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展與白細(xì)胞介素6(IL-6)等關(guān)鍵炎癥因子有關(guān)，IL-6對(duì)HCC的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移起著重要的作用[4]。慢性肝臟炎癥時(shí)血清IL-6表達(dá)升高，而高濃度的IL-6增加HCC的發(fā)生率[5]。癌前病變和肝癌干細(xì)胞均能自分泌IL-6，這種自分泌的IL-6是肝癌進(jìn)展的關(guān)鍵[6]。

硼(Boron)是一種非金屬元素，在自然界中含量較多，多以硼酸鈉(Borax)形式存在，世界衛(wèi)生組織認(rèn)為硼是人體的一種必需營(yíng)養(yǎng)元素，近年來(lái)硼在腫瘤治療及預(yù)防方面越來(lái)越受重視。課題組在探討損傷相關(guān)的分子模式(DAMPs)對(duì)HepG2自分泌IL-6的影響時(shí)，偶然發(fā)現(xiàn)Borax上調(diào)HepG2細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Borax可通過活化p53誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡[7]，這種上調(diào)IL-6表達(dá)的同時(shí)又誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株凋亡的現(xiàn)象與目前眾多文獻(xiàn)報(bào)道IL-6與肝癌的關(guān)系不符，由此引起了我們的關(guān)注：Borax上調(diào)HepG2細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的機(jī)制是什么？本研究在前期基礎(chǔ)上用4.0 mmol/L Borax作用不同時(shí)間點(diǎn)的HepG2細(xì)胞，觀察Borax對(duì)HepG2細(xì)胞自分泌IL-6的影響，并應(yīng)用siRNA基因干擾技術(shù)，沉默HepG2細(xì)胞的MyD88基因，探討B(tài)orax對(duì)HepG2細(xì)胞IL-6表達(dá)的影響與MyD88信號(hào)通路間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及試劑 人肝癌細(xì)胞株HepG2(武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心)；Borax(Sigma-Aldrich，221732)；RPMI-1640培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)；TRIzol Reagent(美國(guó)Incitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑(美國(guó)Fermentas公司)；ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司)；PCR引物(上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)合成)；MyD88-RNAi基因沉默試劑盒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，轉(zhuǎn)染試劑(Therma DharmaFECT 4)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)；CO2培養(yǎng)箱(法國(guó)Thermo公司)；熒光定量PCR儀Rotor Gene-6000(澳大利亞Rotor Gene公司)；全波段酶標(biāo)儀(BioTEK INC，MQX-200)。

1.3 HepG2細(xì)胞的培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI-l640培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2，當(dāng)細(xì)胞覆蓋80%～90%瓶底后，用0.25%的胰酶-EDTA常規(guī)消化傳代，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

1.4 MyD88基因siRNA干擾片段的篩選

1.4.1 siRNA的設(shè)計(jì)制備 在GenBank中查到人MyD88 mRNA序列(編號(hào)：NM_001172567.1)，選擇不同的部位設(shè)計(jì)了4對(duì)MyD88 siRNAs(序列見表1)，并經(jīng)序列相似性軟件比對(duì)不與任何已知基因有同源性。MyD88 siRNAs由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。siRNA成品為已退火的凍干粉，使用前用DEPC水配制成20 μmol/L的工作母液。

1.4.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)MyD88 siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞 在1 OD的siRNA中加入150 μl的DEPC水(公司配送)，得到20 μmol/L的siRNA母液。轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞接種至6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至75%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取2個(gè)2.0 ml的EP管，管1取10 μl 20 μmol/L的siRNA加90 μl DEPC水，加100 μl無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，室溫孵育5 min；管2取4 μl DharmaFECT 4加196 μl無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，室溫孵育5 min。混合管1、管2，上下顛倒混勻，室溫孵育20 min。向上述混合液中加入1 600 μl含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，混勻后加入6孔板。設(shè)立空白對(duì)照組(Control)、陰性對(duì)照組(Negative)、轉(zhuǎn)染試劑組(Reagent)、MyD88-home-316(siRNA-1)、MyD88-home-760(siRNA-2)、MyD88-home-987(siRNA-3)、MyD88-home-1229(siRNA-4)組，各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

表1 MyD88 siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、IL-6和GAPDH正義、反義鏈引物序列

1.4.3 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后MyD88 mRNA的表達(dá)情況 轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞，用RT-PCR方法檢測(cè)各試驗(yàn)組MyD88 mRNA的表達(dá)，篩選出MyD88基因siRNA干擾片段。應(yīng)用TRIzol Reagent總RNA抽提純化試劑盒抽提細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260與A280比值在1.8～2.0范圍。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。在稀釋至25 ng/μl的cDNA中加入SYBR ?GREEN PCR Master Mix和相應(yīng)基因擴(kuò)增引物(序列見表1)，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件：95 ℃，5 min；60 ℃，20 s；72 ℃，1 min，40個(gè)循環(huán)。以目的基因域循環(huán)數(shù)(Threshold cycle，Ct)值對(duì)同一樣本的內(nèi)參照基因GAPDH Ct值進(jìn)行目的基因表達(dá)的相對(duì)定量分析。

1.5 Barox對(duì)HepG2細(xì)胞IL-6表達(dá)的影響

1.5.1 RT-PCR法檢測(cè)IL-6 mRNA的表達(dá) 將1×105個(gè)/ml的HepG2細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔1 ml，0、4.0 mmol/L的Borax共孵育5、10、20、30 min，1、2、6、12、24、48、72 h，各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，收集細(xì)胞，用RT-PCR方法檢測(cè)各試驗(yàn)組IL-6 mRNA的表達(dá)情況。

1.5.2 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的分泌量 將1×105個(gè)/ml的HepG2細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔1 ml，0、4.0 mmol/L Borax共孵育1、2、6、24、48、72 h，各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，收集培養(yǎng)上清液。按照試劑說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6蛋白的含量。

1.5.3 基因沉默技術(shù)觀察Barox上調(diào)HepG2細(xì)胞IL-6表達(dá)與MyD88間的關(guān)系 將1×105個(gè)/ml的HepG2細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔1 ml，細(xì)胞長(zhǎng)至75%左右，用篩選出MyD88基因siRNA干擾片段轉(zhuǎn)染沉默MyD88基因。轉(zhuǎn)染24 h后，與4.0 mmol/L的Borax共孵育24 h。設(shè)空白對(duì)照組、siRNA組、4.0 mmol/L Borax組、siRNA+Borax組，各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。收集細(xì)胞，用RT-PCR方法檢測(cè)各試驗(yàn)組MyD88和IL-6 mRNA的表達(dá)情況，探明Barox上調(diào)HepG2細(xì)胞IL-6表達(dá)與MyD88間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 干擾片段的篩選 與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染24 h后，干擾片段siRNA-1能有效沉默MyD88基因90%以上，干擾片段siRNA-4能有效沉默MyD88基因75%以上，其他干擾片段也能不同程度地沉默MyD88基因，本實(shí)驗(yàn)選擇沉默效果最好的干擾片段siRNA-1做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 MyD88 siRNA干擾片段的篩選

2.2 Borax上調(diào)HepG2細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá) Borax作用HepG2細(xì)胞5 min后，IL-6 mRNA表達(dá)即明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；隨著Borax作用時(shí)間的延長(zhǎng)，IL-6 mRNA表達(dá)逐漸升高，作用24 h時(shí)，IL-6 mRNA表達(dá)到達(dá)高峰；繼續(xù)延長(zhǎng)Borax作用時(shí)間，作用48 h和72 h時(shí)，IL-6 mRNA表達(dá)逐漸下降，但與對(duì)照組比較，IL-6 mRNA表達(dá)仍顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

2.3 Borax對(duì)HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6蛋白表達(dá)的影響 Borax作用HepG2細(xì)胞1 h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6蛋白即明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；隨著Borax作用時(shí)間的延長(zhǎng)，IL-6蛋白表達(dá)逐漸升高，作用48 h時(shí)，IL-6蛋白表達(dá)到達(dá)高峰；繼續(xù)延長(zhǎng)Borax作用時(shí)間至72 h時(shí)，IL-6蛋白較48 h下降，但與對(duì)照組比較，IL-6蛋白仍然高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

圖2 Borax誘導(dǎo)對(duì)HepG2細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)的影響

表2 Borax誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-6蛋白高表達(dá)

2.4 Barox上調(diào)HepG2細(xì)胞IL-6表達(dá)與MyD88間的關(guān)系 RT-PCR結(jié)果如圖3所示，Borax作用24 h對(duì)MyD88基因mRNA的表達(dá)無(wú)影響。干擾片段siRNA-1有效沉默MyD88基因后，加入Borax作用24 h，IL-6 mRNA表達(dá)仍顯著升高，與單一Borax處理組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 MyD88基因沉默后對(duì)Barox上調(diào)HepG2細(xì)胞IL-6 表達(dá)的影響

3 討論

HCC為典型的炎癥相關(guān)性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展與IL-6、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等關(guān)鍵炎癥因子有關(guān)[8]。IL-6與HCC的關(guān)系備受關(guān)注，特別是2007年Naugler等[9]證實(shí)了IL-6在促成小鼠肝細(xì)胞癌方面存在性別差異后，IL-6與肝癌的關(guān)系迅速引起了研究界的關(guān)注。在酒精性肝炎、乙肝、丙肝、脂肪肝等慢性肝臟炎癥時(shí)血清中的IL-6濃度增加，而高濃度的IL-6可能導(dǎo)致HCC的發(fā)生[5]。血清高水平IL-6預(yù)示著慢性乙肝患者將來(lái)可發(fā)展為HCC[10]。HCC患者血清中的IL-6水平比正常人高很多，三期肝癌患者比一期、二期患者的IL-6水平高很多[11]。目前已有很多學(xué)者提出可將循環(huán)中IL-6作為HCC的一種腫瘤標(biāo)記物[12]。

硼在人類新陳代謝中起著重要作用，是生物系統(tǒng)完成生命周期必不可少的元素[13]。有報(bào)道，硼具有防治腫瘤的特性，硼的攝入量與一些癌癥的發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)，提高飲食中硼的含量可降低前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌等的風(fēng)險(xiǎn)[14-16]。作為抗癌藥物，含硼化合物在不能手術(shù)的癌癥和高惡性腫瘤中的使用逐漸增加，其通過抑制絲氨酸蛋白酶、NADPH-脫氫酶、mRNA剪接、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合受體結(jié)合等多種機(jī)制，干擾腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

硼在肝癌防治方面也有眾多進(jìn)展，研究證實(shí)，硼通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)改善暴發(fā)性肝衰竭的肝臟病理學(xué)變化[17]，通過抑制細(xì)胞核增殖抗原的表達(dá)抑制化學(xué)誘導(dǎo)大鼠肝癌的發(fā)生發(fā)展[18]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，硼誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株HepG2凋亡[7]。Borax在誘導(dǎo)HepG2凋亡的同時(shí)上調(diào)了IL-6的表達(dá)，體現(xiàn)了IL-6與肝癌關(guān)系的復(fù)雜性。追溯文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，早在1999年，Kang等[19]就提出了不同的觀點(diǎn)：將IL-6的cDNA轉(zhuǎn)染到小鼠TIB細(xì)胞后移植到小鼠體內(nèi)，前6周沒有生長(zhǎng)，相反空轉(zhuǎn)對(duì)照細(xì)胞在接種后前3周生長(zhǎng)飛快，提示IL-6對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有抑制效應(yīng)。

免疫細(xì)胞產(chǎn)生IL-6有3條主要通路，其中MyD88依賴途徑占主導(dǎo)地位。本課題應(yīng)用基因沉默技術(shù)，分析Borax誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞IL-6表達(dá)上調(diào)是否與MyD88依賴途徑有關(guān)。結(jié)果顯示，4 mmol/L Borax作用5 min后即誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞高表達(dá)IL-6 mRNA，24 h達(dá)高峰，隨后逐漸降低；siRNA-316沉默MyD88后，對(duì)Borax誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞IL-6表達(dá)上調(diào)無(wú)影響。結(jié)果表明，Borax經(jīng)由非MyD88依賴途徑誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞表達(dá)IL-6。

本課題為IL-6與肝癌關(guān)系的復(fù)雜性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，即IL-6在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能起到了一把雙刃劍的作用，并且為更好地了解Borax的抗肝癌作用提供了研究基礎(chǔ)?？傊?，Borax經(jīng)由非MyD88依賴途徑上調(diào)HepG2細(xì)胞表達(dá)IL-6，但Borax上調(diào)HepG2細(xì)胞IL-6表達(dá)的具體機(jī)制及Borax上調(diào)HepG2細(xì)胞IL-6表達(dá)與其誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的關(guān)系尚在進(jìn)一步研究中。