丁萬軍，曾濤，張煜坤，肖祝雅，郭衛(wèi)春，余鈴，戈偉

武漢大學人民醫(yī)院1腫瘤科，3骨科，武漢 430060

2武漢大學人民醫(yī)院東院內(nèi)分泌科，武漢 430075

骨肉瘤是較常見的骨惡性腫瘤之一，發(fā)病部位以股骨遠端和脛骨近端最多見，發(fā)病年齡10～20歲者占60%[1]。截肢術(shù)曾經(jīng)是骨肉瘤的標準治療術(shù)式，但術(shù)后患者的5年生存率不足20%[2]。隨著腫瘤化療的發(fā)展，化療聯(lián)合保肢手術(shù)是新興的治療骨肉瘤的有效策略，可使患者的5年生存率提高近50%[3]。對于晚期骨肉瘤患者，化療是其主要的治療手段。然而有部分骨肉瘤患者因多藥耐藥而對化療不敏感，導致治療失敗，這是影響骨肉瘤患者預后的主要原因之一[4]。因此近年來，關(guān)于骨肉瘤化療耐藥的機制及尋找逆轉(zhuǎn)化療耐藥的新的靶點或藥物，是骨肉瘤相關(guān)研究的熱點和難點。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-π（glutathione-S-transferaseπ，GST-π）是細胞內(nèi)解毒系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，也是目前已經(jīng)證實的與多藥耐藥密切相關(guān)的蛋白[5]。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)并證實的在人類多種腫瘤的發(fā)生、生長及侵襲過程中具有關(guān)鍵作用的信號通路，其在多種腫瘤中激活，參與腫瘤細胞的運動、抵抗凋亡等多個環(huán)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT在腫瘤的多藥耐藥中可能也發(fā)揮重要作用[6]。磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA）基因編碼Ⅰ類PI3K的p110催化亞單位。研究報道，在骨肉瘤中，PIK3CA較正常組織高表達[7]，但其作用機制，尤其是其與骨肉瘤化療耐藥的關(guān)系目前仍不明確。

本文采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測PIK3CA和GST-π在人骨肉瘤MG-63細胞及多藥耐藥細胞株MG-63/多柔比星（doxorubicin，adriamycin，ADM）中的表達水平，旨在探討骨肉瘤中PIK3CA和GST-π表達情況與骨肉瘤化療多藥耐藥的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨肉瘤MG-63細胞株購自武漢大學典型培養(yǎng)物保藏中心；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍、二甲基亞砜購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；雙抗（青霉素、鏈霉素）購自美國Gibco公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；ADM購自美國Sigma公司；細胞周期檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）檢測試劑盒購自武漢科昊佳生物科技有限公司；蛋白抽提-亞細胞結(jié)構(gòu)胞漿和胞核蛋白提取試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，兔抗人β-actin抗體和兔抗人PI3K p110α抗體均購自美國Thermo公司；鼠抗人GST-π單克隆抗體購自美國Santa公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自美國Millipore公司；細胞培養(yǎng)瓶及96孔培養(yǎng)板均購自美國Corning公司；細胞培養(yǎng)箱和自動細胞計數(shù)儀均購自美國Thermo公司；IX70倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；Gel-Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；垂直電泳槽購自北京六一生物科技有限公司；JYECP3000型高壓多用電泳儀購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；UV-1000紫外透射分析儀購自上海鄂禾儀器有限公司；Lambda Bio 20紫外-可見分光光度計購自美國PerkinElmer公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MG-63細胞多藥耐藥株的建立 將復蘇的MG-63細胞移入5 cm×5 cm的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。依據(jù)文獻[8]，先將低濃度的ADM作用于MG-63細胞，然后ADM的濃度逐步遞增，通過間歇作用的方法誘導細胞耐藥。①取對數(shù)生長期的MG-63細胞接種至含ADM的DMEM培養(yǎng)液中。②ADM從0.05 mg/L的低濃度開始，作用48 h后即棄去含ADM的培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。③待MG-63細胞恢復正常生長后行消化傳代，在無菌操作臺中打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，用一次性無菌巴氏吸管吸出細胞懸液，移至10 ml無菌EP管中，1000 r/min離心5 min。吸取離心后的上清液，加入3 ml新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打制成單細胞懸液，吸取1 ml轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液補足至5 ml。在倒置顯微鏡下觀察細胞密度及是否分布均勻，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。④采用濃度為0.1 mg/L的ADM處理傳代培養(yǎng)的細胞48 h。按以上方法，重復ADM處理、換液培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)過程，在此過程中逐步遞增ADM的藥物濃度：0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/ml。將在2.0 μg/ml ADM中可以穩(wěn)定生長時獲得的耐藥細胞株命名為MG-63/ADM，整個耐藥誘導歷時70天。實驗過程中每4周重復檢測1次MG-63/ADM細胞的耐藥性。

1.2.2 MTT法檢測MG-63/ADM細胞的耐藥性培養(yǎng)MG-63、MG-63/ADM細胞至對數(shù)生長期。用0.25%胰蛋白酶消化后離心收集制成單細胞懸液，兩種細胞均以1×104/孔接種于96孔板。置于DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后分組。處理組：加入含2 μg/ml ADM的DMEM培養(yǎng)液；陰性對照組：加入不含藥物的DMEM培養(yǎng)液；空白對照組：無細胞，只加DMEM培養(yǎng)液。每組設(shè)6個復孔。將各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)，取培養(yǎng)24、48、72 h的細胞進行MTT檢測。按照MTT檢測試劑盒中的操作步驟，每孔加入100 μl的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去除上清（不能移走結(jié)晶），每孔加入150 μl的二甲基亞砜，搖床低速振蕩10 min溶解結(jié)晶，全自動酶標儀測定490 nm處的吸光度（optical density，OD）值。

細胞抑制率（inhibition rate，IR）=[1-（處理組OD值-空白對照組OD值）（/陰性對照組OD值-空白對照組OD值）]×100%。根據(jù)文獻[9]中的方法，計算MG-63、MG-63/ADM細胞對ADM的半數(shù)抑制濃度（half effective inhibition concentrations，IC50），根據(jù) IC50計算耐藥指數(shù)（resistance index，RI）[10]。RI=MG-63/ADM細胞IC50/MG-63細胞IC50。

1.2.3 Western blot檢測PIK3CA及GST-TT的蛋白表達 收集培養(yǎng)的MG-63、MG-63/ADM細胞，按細胞質(zhì)和細胞核蛋白提取試劑盒說明分別提取細胞質(zhì)、細胞核蛋白。應用96孔板按BCA蛋白定量試劑盒說明進行蛋白定量，每組3個復孔，紫外分光光度儀檢測562 nm處的OD值，計算蛋白濃度。將蛋白調(diào)整到相同濃度，-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

每孔加入50 μg蛋白，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），電壓為100 V，電泳2～3 h后轉(zhuǎn)PVDF膜，轉(zhuǎn)膜成功后置于5%脫脂奶粉封閉液中，37℃封閉2 h，PBST洗膜，加入一抗PI3K p110α、GST-π及β-actin（1∶10 000稀釋），4℃過夜。第2天用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗膜后加通用型二抗（1∶5000稀釋），37℃孵育1 h，洗膜后電化學發(fā)光法（electrochemiluminescence，ECL）曝光，曝光后的膠片依次顯影、定影，室溫晾干，掃描。采用Imagepro圖像分析軟件分析目的蛋白和β-actin的灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.2.4 RT-PCR檢測PIK3CAmRNA和GST-πmRNA的表達水平 應用RT-PCR方法檢測PIK3CAmRNA和GST-πmRNA的表達水平。選取與檢測PIK3CA蛋白表達同樣分組的6孔細胞，使用Trizol Reagent提取軟骨細胞總RNA，紫外分光光度儀測量其濃度，-70℃保存。用Fermentas RTPCR兩步法試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增。GST-π上游引物為5'-CCCAAGTTCCAGGACGGAGAC-3'，下游引物為5'-TCAGCAGCAAGTCCAGAGGF-3'，擴增片段為325 bp；PIK3CA上游引物為5'-CCTTGTTCAGCTACGCCTTC-3'，下游引物為5'-CATGGTGAACACGTTCTTGG-3'，擴增片段為565 bp；βactin上游引物為5'-CCTGACCGAGCGTGGCTACAGC-3'，下游引物為5'-AGCCTCAGGGCATCGGAAC-3'，擴增片段為205 bp。擴增條件：95℃預變性7 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸55 s，共30個循環(huán)；72℃5 min終止循環(huán)。將擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀下觀察擴增產(chǎn)物的特異條帶。采用Band Scan 5.0軟件行條帶分析，測定條帶的光密度（A）值。以β-actin作為內(nèi)參，目的基因相對表達量=目的基因條帶的A值/β-actin條帶的A值。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測MG-63/ADM細胞的耐藥性

MTT檢測結(jié)果顯示，MG-63/ADM細胞對ADM的IC50和RI均明顯高于MG-63細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 MG-63和MG-63/ADM細胞對ADM的IC50及R（I±s）

表1 MG-63和MG-63/ADM細胞對ADM的IC50及R（I±s）

細胞類型MG-63細胞MG-63/ADM細胞t值P值0.16±0.07 1.97±0.56 7.856 0.000 1.00±0.12 11.35±2.40 10.550 0.000 IC50（μg/ml）RI

2.2 Western blot檢測PIK3CA和GST-π蛋白的表達水平

Western blot檢測結(jié)果顯示，MG-63/ADM細胞中PIK3CA和GST-π蛋白的相對表達量均明顯高于MG-63細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表2、圖1）

表2 MG-63和MG-63/ADM細胞中PIK3CA和GST-π蛋白相對表達量的比較（±s）

表2 MG-63和MG-63/ADM細胞中PIK3CA和GST-π蛋白相對表達量的比較（±s）

細胞類型MG-63細胞MG-63/ADM細胞t值P值0.23±0.06 0.81±0.07 15.410 0.000 0.26±0.07 0.83±0.09 12.246 0.000 PIK3CA蛋白GST-π蛋白

圖1 Western blot檢測不同細胞中PIK3CA和GST-π的表達情況

2.3 RT-PCR檢測PIK3CA mRNA和GST-π mRNA的表達水平

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，MG-63/ADM細胞中PIK3CAmRNA和GST-πmRNA的相對表達量均明顯高于MG-63細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表3）

表3 MG-63和MG-63/ADM細胞中PIK3CA mRNA和GST-π mRNA相對表達量的比較（±s）

表3 MG-63和MG-63/ADM細胞中PIK3CA mRNA和GST-π mRNA相對表達量的比較（±s）

細胞類型MG-63細胞MG-63/ADM細胞t值P值PIK3CA mRNA 0.19±0.06 0.67±0.07 12.753 0.000 GST-π mRNA 0.22±0.04 0.74±0.06 17.664 0.000

2.4 PIK3CA和GST-π蛋白表達的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，MG-63/ADM細胞中PIK3CA與GST-π蛋白的表達呈正相關(guān)（r＝0.866，P＜0.01）。

3 討論

骨肉瘤是發(fā)病率最高的原發(fā)骨惡性腫瘤，以往主要的治療手段是采取截肢手術(shù)，然而術(shù)后患者容易復發(fā)轉(zhuǎn)移，導致預后極差。近年來隨著骨肉瘤化療的發(fā)展，患者的總體預后得到了極大的改善，化療聯(lián)合手術(shù)成為目前的標準治療模式。但部分骨肉瘤患者存在原發(fā)多藥耐藥現(xiàn)象。多藥耐藥性是指對一種藥物具有耐藥性的同時，對其他性質(zhì)不同、作用機制不同的腫瘤化療藥物也具有耐藥性。多藥耐藥是導致腫瘤化療失敗的重要原因之一，并且已經(jīng)成為影響這部分骨肉瘤患者預后的重要因素。因此，建立骨肉瘤多藥耐藥細胞株是體外研究其耐藥機制的基礎(chǔ)。

已有研究證實，通過持續(xù)誘導或大劑量間歇誘導等方法體外建立骨肉瘤多藥耐藥細胞株是可行的[10]。由于大劑量間歇誘導法更接近臨床化療實際，因此本研究采用了大劑量間歇誘導法。骨肉瘤化療的主要藥物包括鉑類、蒽環(huán)類和達卡巴嗪等，其中ADM是骨肉瘤最主要的化療藥物之一[9]。本實驗采取大劑量ADM間歇干預骨肉瘤MG-63細胞進行體外誘導，歷時70天成功建立了骨肉瘤ADM耐藥細胞MG-63/ADM，通過MTT法檢測細胞的耐藥性，結(jié)果證實MG-63/ADM細胞對ADM呈中度耐藥，IC50為（1.97±0.56）μg/ml，RI為（11.35±2.40），說明該耐藥株具有耐藥性。

根據(jù)Krishna和Mayer[11]曾作出的分類標準，可將多藥耐藥分為兩類：典型抗藥機制與非典型抗藥機制。典型抗藥機制中多藥耐藥相關(guān)蛋白及P-糖蛋白（P-gp）發(fā)揮主要的抗藥作用，非典型抗藥機制中谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）及拓撲異構(gòu)酶等在多藥耐藥中發(fā)揮主要作用。

GST是同源二聚體酶超基因家族的一種，有θ、μ、α、π等多種同工酶，其N端谷胱甘肽的結(jié)合位點含有酪氨酸殘基，其羥基可以與硫醇化谷胱甘肽形成氫鍵，在催化反應中具有重要作用，C端為親電子結(jié)合區(qū)，為底物結(jié)合位點[12]。GST-π催化谷胱甘肽（glutathione，GSH）的巰基，使其與多種體內(nèi)或者體外來源的親電化合物結(jié)合，結(jié)合后形成極性較大的復合物，這些復合物可以被多藥耐藥蛋白和P-gp等泵出體外，從而實現(xiàn)GST-π的解毒作用。但同時，大多數(shù)化療藥物也可被GST-π催化與GSH結(jié)合形成GSH-藥物復合物，同樣易被多藥耐藥蛋白泵出體外，使抗腫瘤藥物在體內(nèi)的作用時間變短，不能有效發(fā)揮作用，導致臨床上發(fā)生腫瘤細胞多藥耐藥[13]。通常，GST-π高表達的腫瘤患者更容易耐藥，因此臨床用藥中，GST-π含量可以作為制定腫瘤化療方案的一個重要參考，有些易耐藥的化療藥物就不適用于GST-π含量高的患者。GST-π除了通過直接的細胞解毒，還可以抑制凋亡的MARK通路，抑制腫瘤細胞凋亡而導致耐藥[14]。本研究應用Western blot及RT-PCR方法檢測人骨肉瘤MG-63細胞及耐藥細胞株MG-63/ADM中GST-π蛋白及GST-πmNRA的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MG-63/ADM細胞中GST-π蛋白和GST-πmNRA的相對表達量均明顯高于MG-63細胞（P＜0.01），提示GST-π的過表達可能與骨肉瘤化療耐藥有關(guān)，但GST-π表達的調(diào)節(jié)機制仍不明確。

PIK3CA基因定位于染色體3q26.3，長度為34 kb，包含21個外顯子。PIK3CA基因編碼Ⅰ類PI3K的p110催化亞單位，即PI3K p110a。PI3K p110a具有類脂激酶和蛋白激酶的雙重活性，促使AKT活化，活化的AKT可以磷酸化多種底物，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、遷移、凋亡等有關(guān)的信號通路，因此PI3K/AKT通路在細胞信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮重要作用。約4/5的PIK3CA突變發(fā)生在螺旋區(qū)（exon 9）和激酶區(qū)（exon 20）這兩個熱點區(qū)域，其突變不僅可以減少細胞凋亡，還可以促進腫瘤浸潤，提高下游激酶PI3K的活性，導致PI3K/AKT信號通路的激活[15]。PI3K/AKT信號通路是細胞生長、增殖和抗凋亡的重要調(diào)節(jié)因素，近年來研究表明其與腫瘤耐藥的關(guān)系也十分密切。張棟等[15]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌順鉑耐藥機制與PI3K/AKT信號通路的異常有關(guān)，并且證實通過抑制PI3K/AKT信號通路能增強卵巢癌對順鉑的敏感性。Wang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路的激活可以使結(jié)腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的耐藥性明顯增加。O'Gorman等[16]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路與HL60細胞的耐藥有關(guān)，抑制該信號通路的激活可促進多種化療藥物誘導的HL60細胞凋亡。Gobin等[17]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K突變頻率高和（或）其在腫瘤細胞中的催化功能增加是骨肉瘤增殖轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機制。但目前有關(guān)PIK3CA與骨肉瘤耐藥關(guān)系的研究極少，本研究采用Western blot和RT-PCR方法檢測人骨肉瘤MG-63細胞及耐藥細胞株MG-63/ADM中PIK3CA的蛋白和mRNA表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MG-63/ADM細胞中PIK3CA的蛋白和mRNA相對表達量均明顯高于MG-63細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。同時本研究發(fā)現(xiàn)，MG-63/ADM細胞中PIK3CA與GST-π蛋白的表達呈正相關(guān)，提示PIK3CA可能通過調(diào)控GST-π的表達影響骨肉瘤的化療敏感性。

綜上所述，人骨肉瘤耐藥細胞株MG-63/ADM中PIK3CA和GST-π的mRNA和蛋白表達水平均明顯高于人骨肉瘤MG-63細胞，提示PIK3CA及GST-π可能參與骨肉瘤多藥耐藥過程。同時PIK3CA與GST-π蛋白的表達呈正相關(guān)，提示PIK3CA可能是人骨肉瘤細胞GST-π介導的多藥耐藥的關(guān)鍵機制之一。