白飛榮，姚粟*，田海霞，趙婷，張欣，馬躍，李頌，郝彬秀，程池，王春玲

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015) 2 (中國茶葉有限公司，北京，102209)

發(fā)酵普洱茶是以云南地理標志范圍內(nèi)的大葉種曬青毛茶為原料，并在地理標志范圍內(nèi)經(jīng)過人工渥堆自然接種發(fā)酵而制成的[1]，過程中大量的微生物參與了茶葉物質(zhì)轉(zhuǎn)化，形成了香氣獨特、湯色紅濃、滋味醇厚的感官特征，有降膽固醇和降血脂的保健功效[2-3]，產(chǎn)品形式主要有散茶或緊壓茶。

目前，普洱茶微生物的研究主要集中于其渥堆過程中微生物多樣性分析，從20世紀70年代開始，研究人員已開始關(guān)注發(fā)酵普洱茶中的微生物種類，近幾年來基于高通量測序、宏基因組學的分析技術(shù)，在發(fā)酵普洱茶微生物多樣性分析和功能研究方面已開展了大量的研究工作，并取得了顯著成果[4]。本文通過傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法和基于高通量測序的微生物多樣性分析技術(shù)跟蹤分析了從曬青毛茶至發(fā)酵成熟整個過程的真菌微生物多樣性情況，并采用多相鑒定方法準確鑒定了分離菌種的分類學地位，系統(tǒng)的展現(xiàn)了普洱茶整個發(fā)酵過程中真菌物種的消亡規(guī)律，為發(fā)酵普洱茶微生物安全性評價及功能分析奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與處理

2017年4～6月，于云南省勐?？h百中堂茶莊(經(jīng)緯度E100°27′13′′，N 21°58′57′′；海拔1 136 m)共采集到10份普洱茶樣品，其中樣品G2-G10為跟蹤同一個發(fā)酵茶堆的9個不同發(fā)酵時期的采樣點，BH為發(fā)酵車間環(huán)境取樣，樣品具體信息見表1。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

樣品采集方法：分別從普洱茶發(fā)酵堆上層、中層、下層的四周和中央各選取5個位點，利用滅菌取樣釬在每個位點處取約200 g發(fā)酵茶樣品，所有位點樣品置于取樣袋中充分混勻(共約3 kg)，樣品置于采樣箱冰袋保鮮，運至實驗室后，將樣品分成2等份，1份4 ℃保存用于可培養(yǎng)方法分離，1份于-80 ℃保存用于基因組提取進行高通量測序；發(fā)酵環(huán)境取樣為選取發(fā)酵車間東南西北及中央共5個位點，每個位點放置孟加拉紅瓊脂平板3塊(含氯霉素0.1 g/L)，靜置30 min后，封口置于自封袋中帶回實驗室。

1.2 試劑與儀器

察氏酵母提取粉瓊脂原料(CYA)，麥芽提取粉瓊脂(MEA)，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，孟加拉紅培養(yǎng)基，均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；真菌DNA提取試劑盒，磁珠組織DNA提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司；PCR MasterMix，DL 2000 Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

高速冷凍離心機(5424R)，德國Eppendorf公司；PCR儀(TRIO48)，德國Biometra公司；微量核酸蛋白分析儀(BioDrop-μLite)，英國Biochrom有限公司；電泳儀(EC250-90)，美國BIO-RAD公司；恒溫培養(yǎng)箱(GHP-9160)，上海一恒科學儀器有限公司；光學顯微鏡(尼康80i)，日本Nikon公司；測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成；Illumina Miseq高通量測序由深圳華大基因科技有限公司完成。

1.3 可培養(yǎng)分析方法

1.3.1 樣品可培養(yǎng)真菌的分離純化

四分法縮分后準確稱取發(fā)酵茶樣品25 g，置于225 mL滅菌生理鹽水中，30 ℃ 150 r/min振蕩1 h，制成10倍稀釋液(10-1)，取1 mL稀釋液于9 mL滅菌生理鹽水的試管中，依次稀釋后制成 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等濃度梯度稀釋液，選取10-3、10-4、10-5、10-6四個稀釋度，用移液槍吹吸混勻后分別吸取100 μL稀釋液涂布于孟加拉紅平板培養(yǎng)基上(含氯霉素0.1 g/L)，每個稀釋度3個平行，置于30 ℃、45℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)，從第2天開始根據(jù)菌落表型特征(包括大小、形狀、顏色、質(zhì)地、有無滲透液、有無可溶性色素等)依次挑取各種特征菌落于PDA平板上(含氯霉素0.1 g/L)進行劃線分純[5]，并參照國標GB4789進行菌株計數(shù)[6]，共計5 d。分純后轉(zhuǎn)接于PDA試管斜面進行保存。

發(fā)酵車間環(huán)境菌株分離：將環(huán)境取樣的孟加拉紅瓊脂平皿置于30 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)，從第2天開始根據(jù)菌落表型特征對平板上的單菌落進行分離并計數(shù)，共5 d。

1.3.2 樣品中可培養(yǎng)真菌的多相鑒定

形態(tài)學鑒定：將分純得到的霉菌三點接種于CYA、MEA或PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)3～14 d，酵母菌劃線接種于MEA平板上，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，利用單反相機拍攝菌落照片，觀察菌落直徑、顏色、質(zhì)地、邊緣是否完整、長勢強弱、表面特征、反面顏色、是否產(chǎn)生滲出液和可溶性色素等形態(tài)特征；利用光學顯微鏡進行顯微形態(tài)的觀察，拍照并測量菌株產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)大小，觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的發(fā)生方式，菌絲顏色及表面粗糙程度，孢子的顏色、大小及形狀，是否產(chǎn)生厚垣孢子以及產(chǎn)生方式，是否產(chǎn)生有性生殖結(jié)構(gòu)以及有性孢子的大小形狀等特征。

分子生物學鑒定：利用真菌基因組提取試劑盒提取分離菌株的DNA，再利用核糖體翻譯間隔序列(ITS)、核糖體rDNA大亞基(26S D1/D2)、β微管蛋白基因(β-tubulin)、鈣調(diào)蛋白基因(calmodulin)、肌動蛋白基因(actin)等分子標記引物進行絲狀真菌和酵母菌的核酸序列擴增及測序(引物信息見表2)，測序序列上傳至NCBI核酸數(shù)據(jù)庫，將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，下載與目標菌株相近種的模式菌株序列，采用ClustalX 1.83進行多序列比對[7]，再用MEGA 5.0進行鄰接法(neighbor joining)聚類系統(tǒng)發(fā)育及分子進化分析[8]。

表2 引物信息Table 2 Primer Information

1.4 基于高通量測序的真菌多樣性分析

1.4.1 DNA提取及高通量測序

將樣品充分混勻，每份樣品隨機取樣3次(每次2 g)分別用液氮充分研磨，通過磁珠組織DNA提取試劑盒提取樣品基因組，利用微量核酸蛋白分析儀檢測DNA濃度及純度，將3個重復(fù)提取的基因組DNA混合，利用Illumina Miseq 2×250 bp paired-end高通量測序平臺對真菌翻譯間隔序列ITS1區(qū)進行雙末端測序。

1.4.2 高通量測序數(shù)據(jù)分析

下機數(shù)據(jù)經(jīng)過濾，除掉低質(zhì)量的reads，使用軟件FLASH將雙末端測序的reads通過之間的overlap關(guān)系拼接成Tags[15-16]；利用軟件USEARCH在97%相似度下將拼接好的Tags聚類，得到OTU(Operational Taxonomic Units)的代表序列[17]，通過RDP classifer軟件將OTU代表序列與真菌ITS數(shù)據(jù)庫(UNITE)比對進行物種注釋[18]；基于OTU和物種注釋結(jié)果對樣品中真菌物種豐度與多樣性進行分析。根據(jù)各樣品中物種豐度差異，利用軟件QIIME采用迭代算法對樣品進行聚類分析并計算樣品間距離[19]，以判斷各樣品物種組成的相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中可培養(yǎng)真菌的分離與鑒定

可培養(yǎng)方法共分離到真菌純培養(yǎng)物107株，其中霉菌75株，酵母菌32株，通過形態(tài)學與核酸序列分析可知霉菌為7個屬共12種(包含潛在新種4種)，酵母菌為4個屬共4種；根據(jù)分離平板所對應(yīng)的稀釋度估算分離菌種在每克樣品中的數(shù)量，菌株分離鑒定信息見表3，菌落形態(tài)及顯微形態(tài)見圖1。

表3 菌種分離及鑒定信息Table 3 Isolation and identification information of strains

圖1 分離菌種的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)Fig.1 Colony morphology and microscopic morphology of isolated strains 注：照片A1至P2對應(yīng)的菌種信息見表3

根據(jù)表3可知，發(fā)酵茶中數(shù)量達到103CFU/g的菌種共11種，包括8種霉菌：琉球曲霉(Aspergillusluchuensis)、新黑曲霉(Aspergillusneoniger)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、傘枝橫梗霉(Lichtheimiacorymbifera)、青霉屬(Penicilliumsp.)、枝孢菌屬(Cladosporiumsp.)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)、間座殼屬(Diaporthesp.)；3種酵母：食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(Blastobotrysadeninivorans)、法布里德巴利酵母(Debaryomycesfabryi)、布蘭克假絲酵母(Candidablankii)。其中琉球曲霉(Aspergillusluchuensis)、新黑曲霉(Aspergillusneoniger)、食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(Blastobotrysadeninivorans)、布蘭克假絲酵母(Candidablankii)在發(fā)酵前期及后期均大量分離到，屬于主發(fā)酵菌種；法布里德巴利酵母(Debaryomycesfabryi)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、枝孢菌屬(Cladosporiumsp.)、青霉屬(Penicilliumsp.)主要分離于發(fā)酵前期樣品；間座殼屬(Diaporthesp.)屬于植物病原菌，主要分離于曬青毛茶；黃色類蝴蝶銀耳(Papiliotremaflavescens)只在曬青毛茶中分離到，米根霉(Rhizopusoryzae)只在環(huán)境樣品中分離到。另外，共發(fā)現(xiàn)新種4種：包括青霉屬2種、枝孢菌1種、間座殼屬1種。

2.2 樣品高通量測序真菌多樣性分析

2.2.1 樣品檢測及OTU統(tǒng)計分析

利用軟件USEARCH在97%相似度下將測序得到的Tags聚類，9個樣品共產(chǎn)生189個OTU，每個樣品測序得到的Tags數(shù)量、OTU數(shù)量及香濃指數(shù)見表4。通過shannon和simpson指數(shù)反映出普洱茶發(fā)酵過程真菌物種多樣性，Chao1和ACE指數(shù)反映出普洱茶發(fā)酵過程中真菌物種豐度，數(shù)值越大豐度越高[20]，由表4可知發(fā)酵前期樣品真菌多樣性較高，其中曬青毛茶(G2)中微生物數(shù)量最多，香濃指數(shù)最高。

表4 各樣品測序結(jié)果Tags數(shù)量、OTU數(shù)量及香濃指數(shù)Table 4 The number of Tags, OTU and the fragrance index of the sequencing results of each sample

2.2.2 基于ITS1序列分析各樣品中真菌屬級單元多樣性及豐度

將上述聚類得到的189個OTU的代表序列與真菌ITS數(shù)據(jù)庫(UNITE)比對，進行物種注釋，189個OTU歸屬于69個屬(詳見表5)，各樣品中屬水平的多樣性分布見圖2。由表5和圖2可知，發(fā)酵普洱茶樣品中真菌主要以子囊菌門(Ascomycota)為主，擔子菌門(Basidiomycota)和接合菌門(Zygomycota)物種多樣性和豐度均較低，大部分真菌主要分布在發(fā)酵前期。各樣品中豐度大于1%的屬級分類單元包括：芽生葡萄孢酵母屬(Blastobotrys)、假絲酵母屬(Candida)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)、枝孢菌屬(Cladosporium)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)，其中芽生葡萄孢酵母屬(Blastobotrys)和假絲酵母屬(Candida)真菌在普洱茶整個發(fā)酵過程均能分析到，將二者的ITS1代表序列進行NCBI Blast比對，被分別鑒定為“食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(Blastobotrysadeninivorans)”和“布蘭克假絲酵母(Candidablankii)”，其中“食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(Blastobotrysadeninivorans)”豐度高達70%以上，為絕對優(yōu)勢種，與可培養(yǎng)方法結(jié)果一致；德巴利酵母菌屬(Debaryomyces)在發(fā)酵前期較優(yōu)勢，發(fā)酵后期少量分離到；枝孢菌屬(Cladosporium)主要存在于曬青毛茶中，豐度達到13%；根毛霉屬(Rhizomucor)真菌在發(fā)酵前期和后期均分離到，發(fā)酵中期第1次翻堆時豐度較高；樣品G2(曬青毛茶)真菌多樣性最高，G3(發(fā)酵3 d)、G4(第1次翻堆)真菌多樣性較高。

表5 各樣品中真菌屬級分類單元的豐度 單位：%

續(xù)表5

分類單元樣品名稱門屬G2G3G4G5G6G7G8G9G10AscomycotaLectera0.01--------AscomycotaPlectosphaerella0.10--------AscomycotaVerticillium0.15-0.08---0.02--AscomycotaPestalotiopsis0.37-0.02------AscomycotaDiatrypella0.04--------AscomycotaMonographella0.01--------AscomycotaLalaria0.01--------BasidiomycotaCryptococcus0.03---0.01----BasidiomycotaExobasidium0.01--------BasidiomycotaRhodotorula0.19--0.01-----BasidiomycotaSporobolomyces0.01--------BasidiomycotaSporidiobolus0.01-0.98------BasidiomycotaGuehomyces0.01--------BasidiomycotaItersonilia0.02--------BasidiomycotaMrakia0.04--------BasidiomycotaUdeniomyces0.02--------BasidiomycotaNaganishia0.03-0.02------BasidiomycotaUnclassified0.130.03BasidiomycotaFilobasidium0.01--------BasidiomycotaBullera0.01--------ZygomycotaLichtheimia--0.020.060.03--0.01-ZygomycotaRhizomucor0.020.010.410.010.050.08--0.01

注：“-”表示樣品中未檢測到該屬真菌。

圖2 真菌屬級分類單元在各樣品中分布Fig.2 The taxonomic composition distribution in samples at genus-level

2.2.3 樣品間物種組成聚類分析

各樣品間物種組成聚類分析結(jié)果詳見圖3，樣品間越靠近，枝長越短，說明2個樣品的物種組成越相似，由圖3可知樣品G2(曬青毛茶)與其他發(fā)酵階段的樣品中真菌多樣性相差最遠，發(fā)酵階段前期樣品G3、G4、G5、G6聚為一支，較相近；發(fā)酵后期G7、G8、G9、G10聚為一支，較相近。

圖3 樣品聚類分析圖Fig.3 Clustering results of samples

3 討論

本研究通過可培養(yǎng)方法從勐海百中堂茶莊普洱茶整個發(fā)酵過程分離到可培養(yǎng)真菌107株，共11個屬，16個種，優(yōu)勢種包括琉球曲霉(Aspergillusluchuensis)、新黑曲霉(Aspergillusneoniger)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、青霉菌(Penicilliumsp.)(潛在新種)、枝孢菌(Cladosporiumsp.)(潛在新種)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)、傘枝橫梗霉(Lichtheimiacorymbifera)、食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(Blastobotrysadeninivorans)、法布里德巴利酵母(Debaryomycesfabryi)、布蘭克假絲酵母(Candidablankii)。與傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法比，高通量測序更全面地展現(xiàn)了勐海發(fā)酵普洱茶樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)，揭示發(fā)酵過程真菌微生物主要為子囊菌，擔子菌和接合菌次之，高通量測序共分析到真菌69個屬(包括子囊菌54屬，擔子菌13屬，接合菌2屬)，共189個OTU，包含了可培養(yǎng)方法所有分離菌種對應(yīng)的屬級分類單元，根據(jù)龐雄飛等的優(yōu)勢屬劃分原則[21]，可知“芽生葡萄孢酵母屬(Blastobotrys)”為整個發(fā)酵過程優(yōu)勢屬；“假絲酵母屬(Candida)”在發(fā)酵3 d和15 d的樣品中豐度達到20%，為前期優(yōu)勢屬；“枝孢霉屬(Cladosporium)”在曬青毛茶樣品中為優(yōu)勢屬，豐度達到13.79%，3種優(yōu)勢屬均與可培養(yǎng)方法結(jié)果相吻合。由高通量測序結(jié)果可知曬青毛茶中微生物多樣性最高，且大部分菌種豐度均小于1%，其中部分種可能只是以死菌的形式存在于毛茶中，而導(dǎo)致可培養(yǎng)方法沒有分離得到。另外可培養(yǎng)方法顯示曲霉菌為普洱茶發(fā)酵過程優(yōu)勢菌，但高通量技術(shù)分析結(jié)果顯示曲霉菌豐度較低，且在后期沒有分析到該屬真菌，可能是曲霉菌后期凋亡較快，基因組降解嚴重而導(dǎo)致的。綜合考慮，高通量技術(shù)更能全面宏觀的反映普洱茶發(fā)酵過程微生物多樣性及物種消亡規(guī)律，而可培養(yǎng)方法分離到一些豐度較高的優(yōu)勢菌種，有利于菌種的進一步開發(fā)研究。

綜合2種方法研究結(jié)果可知，發(fā)酵前期真菌多樣性較后期高，其中法布里德巴利酵母(Debaryomycesfabryi)、枝孢菌(Cladosporiumsp.)、青霉菌(Penicillium)主要分布于普洱茶發(fā)酵前期，法布里德巴利酵母主要產(chǎn)酯酶，枝孢菌和青霉菌可產(chǎn)纖維素酶、脂肪酶可水解毛茶基質(zhì)纖維素[22]；曲霉菌(Aspergillus)主要分布于普洱茶發(fā)酵前期及中期，代謝產(chǎn)生有機酸以及多酚氧化酶、糖化酶、果膠酶、纖維素酶、單寧酶等酶類，是前中期茶葉粗纖維組織軟化、促進大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要菌種[22-23]；布蘭克假絲酵母(Candidablankii)、傘枝橫梗霉(Lichtheimiacorymbifera)、微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)主要分布于普洱茶發(fā)酵中期，該3個菌種均為耐高溫菌種[24-26]，推測其在普洱茶發(fā)酵中期的高溫環(huán)境下發(fā)揮重要作用；食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(Blastobotrysadeninivorans)屬于整個發(fā)酵過程優(yōu)勢種，其可培養(yǎng)數(shù)量可達到107CFU/g，發(fā)酵后期豐度達到99%以上，該菌種耐高溫，發(fā)酵可產(chǎn)生蛋白酶、酯酶、沒食子酸脫羧酶[27]，對普洱茶發(fā)酵過程的物質(zhì)轉(zhuǎn)變及風味形成具有重要的貢獻[28]。此外，研究結(jié)果顯示優(yōu)勢種屬在曬青毛茶原料中均有分布，少部分分離自發(fā)酵環(huán)境，推測普洱茶發(fā)酵的優(yōu)勢真菌主要來源于曬青毛茶原料。

本研究分離到大量的曲霉屬黑色組真菌(Aspergillussection Nigri)，其與普洱茶渥堆過程中茶堆表面可見的大量黑色曲霉菌的表觀現(xiàn)象相吻合，多相鑒定結(jié)果顯示這些菌種應(yīng)為琉球曲霉(Aspergillusluchuensis)和新黑曲霉(Aspergillusneoniger)，二者在普洱茶中均為首次報道，與已有報道的普洱茶發(fā)酵過程中優(yōu)勢種為黑曲霉(Aspergillusniger)[29-30]、塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)[31]結(jié)果均不一致，因為已有的文獻研究中只應(yīng)用了真菌通用的ITS rDNA序列進行分析，而“琉球曲霉、新黑曲霉、黑曲霉、塔賓曲霉”四者在ITS水平序列相似性為100%，無法區(qū)分開，需結(jié)合微管蛋白基因(β-tubulin)和鈣調(diào)蛋白基因(calmodulin)才可區(qū)分四者。另外，法布里德巴利酵母(Debaryomycesfabryi)在普洱茶中屬于首次報道，其需通過26S rDNA序列結(jié)合肌動蛋白基因(actin)才可以準確鑒定至種水平，否則容易誤鑒定為“漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)”。

發(fā)酵普洱茶安全問題一直備受關(guān)注，大量研究報道普洱茶易受黃曲霉毒素污染[32-33]，本研究未分析到產(chǎn)黃曲霉毒素的菌種，但本研究分離到的煙曲霉(Aspergillusfumigatus)是公認的臨床致病菌，其主要導(dǎo)致侵襲性肺曲霉病[34]，且該菌種可產(chǎn)生煙曲霉素、膠霉毒素等致病真菌毒素[25]，已有大量文獻報道該菌種存在于發(fā)酵普洱茶中[35]，本研究顯示在發(fā)酵7 d的樣品中分離率達到每克104CFU/g的菌落數(shù)，建議發(fā)酵過程中參與翻堆工作的茶廠工人做好相關(guān)防護，發(fā)酵完成的普洱熟茶應(yīng)進行相關(guān)的霉菌毒素檢測。另外，微小根毛霉、傘枝橫梗霉等菌種為機會致病菌，可引起接合菌病[22,25]，免疫低下者應(yīng)進行相關(guān)防護。而優(yōu)勢菌“食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(Blastobotrysadeninivorans)”、“布蘭克假絲酵母(Candidablankii)”、“琉球曲霉(Aspergillusluchuensis)”均未見產(chǎn)毒素和致病性報道[24,36]。

普洱茶發(fā)酵過程中，大量的微生物參與了物質(zhì)轉(zhuǎn)化，對這些微生物分類學名稱的準確鑒定是發(fā)酵普洱茶微生物安全性評價及功能性分析的重要基礎(chǔ)，弄清楚這些微生物的功能關(guān)系是普洱茶自然開放式發(fā)酵工藝改進的前提條件。本文分析到的普洱茶真菌微生物的具體功能及安全性有待進一步研究。