徐寧 王麗麗 付士平

(1上海市第八人民醫(yī)院骨科，上海 200235；2蚌埠醫(yī)學院研究生院)

股骨頭骨骺壞死是髖脫位治療后的常見并發(fā)癥之一，股骨頭骨骺壞死發(fā)生的時間與先天性髖脫位治療后缺血的時間并不一致，骨骺損傷在恢復血液供應后仍然有加重的現(xiàn)象，認為其與缺血后再灌注損傷有關〔1〕。研究證明，丙泊酚對肝臟、腦、腎等器官的缺血再灌注損傷有保護作用，然而其是否對股骨頭骨骺缺血再灌注損傷具有保護作用不明確〔2，3〕。本研究以新西蘭兔建立股骨頭骨骺缺血再灌注模型，探討丙泊酚對股骨頭骨骺缺血再灌注的保護作用，分析其保護機制，旨在為缺血再灌注損傷的預防提供理論支持。

1 資料與方法

1.1實驗動物 1月齡健康新西蘭兔93只，雌雄不限，平均體重(1.1±0.2)kg，購于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所。

1.2主要試劑 全蛋白提取試劑盒(碧云天生物技術研究所)；BCA蛋白定量試劑盒(康肽生物科技北京有限公司)；Western一抗、二抗稀釋液(碧云天生物技術研究所)；兔抗鼠Bcl-2、Bax單克隆抗體(美國Epitomics公司)；β-actin一抗(Santa Cruz公司)；TUNEL檢測試劑盒(上海銘博生物科技有限公司)；其他試劑均為分析純國產試劑。

1.3主要儀器 超凈工作臺(AIRTECH，蘇州凈化設備有限公司)，RT-PCR儀(美國BIO-RAD公司)，自動生化分析儀(貝克曼庫爾特AU680)，電生理刺激儀(蘇州市東方電子儀器廠)，精密電子天平(Adventurer 公司，美國)，酶標儀(上海安亭科學儀器廠)，紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠)，雙垂直蛋白電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.4動物分組和股骨頭骨骺缺血再灌注模型的建立 93只新西蘭兔分為模型組(n=45)、丙泊酚組(n=45)和正常組(n=3)。模型組采用完全隨機的方法分為缺血4、8、12 h組，每組15只；3組分別在缺血4、8、12 h再灌注，再灌注后即刻、4、24、72、168 h每組分別處死3只兔。丙泊酚組分組同前，處理上的區(qū)別：僅在缺血前、后加靜脈注射適量丙泊酚處理。依據Yokota等〔4〕方法，采用髂總動脈阻斷-開放法建立股骨頭骨骺缺血再灌注新西蘭兔模型。選取左側股骨頭為實驗側。烏拉坦(20 g/L)麻醉成功后，于下腹部正中入路分離髂總動脈，于兩側髂總動脈分叉處采用無創(chuàng)血管夾夾閉左側髂總動脈，不阻斷髂總靜脈。觀察足趾末梢毛細血管充盈情況。丙泊酚組在缺血前 10 min 經尾靜脈緩慢注射負荷劑量的丙泊酚(20 mg/kg)，缺血后尾靜脈泵注丙泊酚(20 mg·kg-1·h-1)直至處死。術后縫合皮膚，肌肉注射青霉素80萬U、2～3 d。

1.5檢測指標

1.5.1HE染色 常規(guī)石蠟包埋，取石蠟包埋標本，連續(xù)切片，片厚4 μm，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察缺血區(qū)軟骨細胞、骨髓細胞和骨骺骨細胞的形態(tài)學改變。

1.5.2細胞凋亡檢測 取石蠟包埋標本，連續(xù)切片，片厚4 μm，采用TUNEL法標記凋亡細胞，10 g/L伊文氏藍襯染。熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，未凋亡細胞呈現(xiàn)紅色，凋亡的細胞核發(fā)出綠色熒光，計算1 000個細胞中的凋亡比例。

1.5.3Western印跡檢測Bcl-2、Bax蛋白表達水平 取完整股骨頭軟骨，剪刀切碎，提取總蛋白，12%的凝膠分離蛋白質，在100 V 1.5 h的條件下利用轉膜儀(濕轉)將凝膠上的蛋白轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封閉2 h，洗膜后與稀釋的Bcl-2、Bax單克隆抗體(1∶1 000)過夜結合，洗模后加入稀釋的二抗，室溫孵育60 min，BeyoECL Plus顯色，凝膠成像和化學發(fā)光分析系統(tǒng)收集顯色條帶，運用 Quantity One 軟件進行蛋白條帶數(shù)據分析。

1.6統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0軟件行χ2檢驗或t檢驗。

2 結 果

2.1HE染色 正常組軟骨細胞、骨髓細胞和骨骺骨細胞包膜完整，排列整齊，無變性壞死等改變。模型組缺血4、8、12 h，缺血區(qū)部分軟骨細胞、骨髓細胞和骨骺骨細胞發(fā)生核固縮；再灌注4、24、72、168 h，核固縮明顯增多，部分出現(xiàn)核碎裂，并可見少數(shù)核溶解。丙泊酚組軟骨細胞、骨髓細胞和骨骺骨細胞病理損傷核固縮均減輕，但未能恢復正常。

2.2細胞凋亡情況 正常組骨骺細胞的凋亡率僅為(3.15±0.89)%。模型組和丙泊酚組缺血再灌注4、24、72、168 h后骨骺細胞的凋亡率顯著高于缺血再灌注即刻(P<0.05)。與模型組同時刻相比，丙泊酚組骨骺細胞的凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3Bax/Bcl-2蛋白表達水平 正常組Bax/Bcl-2比值僅為0.16±0.09。模型組和丙泊酚組缺血再灌注4、24、72、168 h，Bax/Bcl-2比值顯著高于缺血再灌注即刻(P<0.05)。與模型組同時刻相比，丙泊酚組Bax/Bcl-2比值顯著降低(P<0.05)。見表2。

表1 各組缺血再灌注后骨骺細胞的凋亡率

與本組即刻相比：1)P<0.05；與同期模型組相比：2)P<0.05；下表同

表2 各組缺血再灌注后Bax/Bcl-2比值

3 討 論

缺血再灌注組織損傷的主要原因之一是缺血再灌注損傷產生的自由基，如活性氧可破壞細胞基礎蛋白質、脂質膜和DNA等關鍵生物分子〔5〕。丙泊酚具有酚羥基結構，可在生物體中作為供氫體與自由基反應，故可清除自由基而表現(xiàn)出抗氧化活性〔6〕。

股骨頭缺血性壞死模型的構建方法很多，但成功的模型不多。本研究采用夾閉髂總動脈的方法構建股骨頭缺血性壞死模型，不破壞局部血管、神經，盡可能降低外在因素對股骨頭的干擾，成功阻斷了主要血運，導致大部分缺血。同時，該方法不夾閉髂總靜脈，因此不影響血液回流。HE染色結果顯示，缺血再灌注早期股骨頭軟骨細胞、骨髓細胞和骨骺骨細胞形態(tài)結構基本正常，隨著缺血再灌注時間延長，細胞形態(tài)結構逐漸紊亂，可見核固縮或細胞壞死，表明該方法構建的股骨頭缺血性壞死模型對股骨頭組織細胞造成了進一步損傷，與文獻〔7，8〕報道結果一致。

本研究結果顯示，丙泊酚可減輕新西蘭兔股骨頭骨骺缺血再灌注損傷。推測丙泊酚缺血前、后聯(lián)合給藥可顯著增強股骨頭對抗缺血再灌注損傷的能力，從而延長缺血耐受時限，這種保護作用與丙泊酚的抗過氧化反應有關。但丙泊酚的這種保護作用是否直接通過其抗脂質過氧化能力尚需進一步分析。余奇勁等〔9〕報道，丙泊酚對兔脊髓缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，并推測該作用機制與抗過氧化反應有關。朱敏等〔10〕報道，丙泊酚對腦缺血再灌注大鼠有腦保護作用，可能與其促進ADAR2蛋白核轉位、增加腺苷脫氨酶受體有關。

細胞凋亡是指細胞通過基因嚴密調控的主動的程序性死亡〔11〕。Bcl-2是B細胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因，該基因是一個多基因家族，其中Bax和Bcl-2是該家族中的兩個主要成員，前者有促凋亡作用，而后者則有抗凋亡的作用〔12〕。Bax/Bcl-2比值大小可預示細胞凋亡程度。本研究結果說明缺血再灌注期間抗凋亡基因Bcl-2的表達受到了抑制，而促凋亡基因Bax表達占優(yōu)勢；丙泊酚的應用可改善這一狀態(tài)，這與HE染色檢查結果一致。

綜上所述，丙泊酚可以減輕兔股骨頭骨骺缺血再灌注誘發(fā)的損傷，其機制可能與促進抗凋亡基因Bcl-2的表達、抑制Bax表達，從而進而減輕細胞凋亡有關。