馮波 王聰 馮志

(江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院血管外科，江西 南昌 330003)

糖尿病足潰瘍是一種體表潰瘍，主要的治療思路是祛腐和生肌，從分子生物學(xué)的角度來(lái)看，糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合的過(guò)程是組織細(xì)胞分化、增殖、迀移、凋亡的過(guò)程〔1〕。皮膚原位再生醫(yī)療技術(shù)(MEBT/MEBO)具有減少創(chuàng)面感染、消炎止痛、抑制瘢痕組織增生的作用，常用于治療燒傷創(chuàng)面，目前臨床上用其治療糖尿病足潰瘍創(chuàng)面也取得了較好的效果，然而其具體的作用機(jī)制尚不明確〔2〕。近年來(lái)的研究顯示〔3,4〕，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1/smad信號(hào)通路及Wnt/β-catenin信號(hào)通路是創(chuàng)面愈合的重要調(diào)控途徑，TGF-β1及磷酸化smad3(P-smad3)蛋白是TGF-β1/smad信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，β-catenin mRNA對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路起到重要的調(diào)控作用。本研究旨在進(jìn)一步明確MEBT/MEBO治療糖尿病足潰瘍的作用機(jī)制，為臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取50只雄性SPF級(jí)SD大鼠，體重206～251 g，平均(225.7±8.6)g，自由進(jìn)食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在(25.0±1.0)℃，環(huán)境濕度控制在(50.0±5.0)%，每天給予12 h光照時(shí)間，分籠喂養(yǎng)，每籠10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)大鼠由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào) SCXK(京)2012-0001。本研究方案符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理學(xué)要求。

1.2建模及分組方法 建模方法：建模前所有大鼠均禁食12 h，隨機(jī)選取其中40只，采用pH4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液將鏈脲佐菌素稀釋成1%的溶液，腹腔注射，劑量為60 mg/kg，注射后7 d測(cè)血糖，糖尿病大鼠建模以血糖大于16.7 mmol/L認(rèn)為成功，將同等劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射到另外10只大鼠。本研究有32只大鼠成功建造為糖尿病大鼠模型，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法取其中的30只分為模型對(duì)照組、MEBT/MEBO組、貝復(fù)濟(jì)組，每組10只，正常對(duì)照組為10只正常大鼠。各組大鼠建造足潰瘍模型步驟：首先在足背部做3 mm×7 mm的長(zhǎng)方形標(biāo)記，然后局部消毒后沿著標(biāo)記剪去全層皮膚直至筋膜。造模成功后所有大鼠自由進(jìn)食飲水，并對(duì)模型對(duì)照組、MEBT/MEBO組、貝復(fù)濟(jì)組大鼠的血糖進(jìn)行監(jiān)測(cè)，1次/w，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中三組大鼠的血糖控制在16.7～20.0 mmol/L。

1.3治療方法 在足潰瘍大鼠模型建造當(dāng)天進(jìn)行治療，其中正常對(duì)照組、模型對(duì)照組做如下處理：在創(chuàng)面上敷兩層生理鹽水浸泡過(guò)的紗布后覆蓋無(wú)菌敷料，并且膠布固定。MEBT/MEBO組采用濕潤(rùn)燒傷膏(汕頭市美寶制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20000004，規(guī)格：每支40 g)進(jìn)行治療，將軟膏涂于創(chuàng)面，涂抹均勻，外敷兩層MEBT/MEBO紗布，覆蓋無(wú)菌敷料，膠布固定。貝復(fù)濟(jì)組在創(chuàng)面上敷兩層用重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)外用溶液(珠海億勝生物制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字S19991021，規(guī)格：35 000 IU/瓶)浸泡過(guò)的紗布，覆蓋無(wú)菌敷料，膠布固定。所有大鼠在上藥前均用呋喃西林溶液進(jìn)行消毒，每隔2 d換一次藥，共2 w。

1.4創(chuàng)面觀察 治療8 d時(shí)，采用滌綸投影膜對(duì)創(chuàng)面的大小進(jìn)行描計(jì)，并用MIAS2000圖像分析軟件進(jìn)行分析，創(chuàng)面愈合率=創(chuàng)面愈合面積/初始創(chuàng)面面積×100%。統(tǒng)計(jì)每只大鼠創(chuàng)面完全愈合的時(shí)間，計(jì)算每組大鼠的平均創(chuàng)面愈合時(shí)間。

1.5蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TGF-β1、P-smad3蛋白 在治療8 d時(shí)，采用7%水合氯醛0.5 ml/100 g腹腔注射進(jìn)行麻醉。取潰瘍創(chuàng)面新生肉芽組織，液氮處理，然后置于-80℃保存待測(cè)。取適量處理后的新生肉芽組織，研磨后加入裂解液，4℃下勻漿5 min，然后進(jìn)行1 h的冰浴，4℃、13 000 r/min離心15 min，取上清液作為樣品。蛋白含量測(cè)定采用BCA法，取適量樣品，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，后轉(zhuǎn)移于聚偏二氟乙烯膜上，加入5%的脫脂奶粉后搖床封閉2 h，加入一抗(TGF-β1、P-smad3多克隆抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司)4℃孵育過(guò)夜。用Tris鹽酸緩沖液(TBS)清洗聚偏二氟乙烯膜3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫避光孵育2 h，采用TBST緩沖液充分洗滌，然后使用化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒顯影，目標(biāo)蛋白的灰度值采用凝膠成像系統(tǒng)和Image J軟件進(jìn)行分析，β-actin作為內(nèi)參。

1.6RT-PCR檢測(cè)β-catenin mRNA 治療8 d時(shí)，取四組處理后的新生肉芽組織，研磨后加入裂解液，充分混勻，4℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液，加200 μl氯仿，充分混勻，靜置5 min。4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，加入等體積的異丙醇，充分混勻，靜置5 min。4℃、12 000 r/min離心15 min，取上層血清，加入1 ml乙醇,靜置2 min；4℃、8 000 r/min離心5 min，將上清液舍去，加入20 μl無(wú)酶水，吹打至RNA充分溶解，提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物序列：β-catenin：上游引物：5′-GGAACTATGACCTCGACTACGAC-3′，下游引物：5′-ACCATGTCTCCTACAGTAGCTC-3′；GAPDH：上游引物：5′-CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT-3′，下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；然后40個(gè)循環(huán)：95℃變性10 s、60℃退火30 s；70℃延伸45 s。GAPDH為內(nèi)參。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1四組治療8 d的創(chuàng)面愈合率和平均創(chuàng)面愈合時(shí)間比較 四組平均創(chuàng)面愈合時(shí)間和治療8 d的創(chuàng)面愈合率整體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，模型對(duì)照組的平均創(chuàng)面愈合時(shí)間高于正常對(duì)照組、MEBT/MEBO組、貝復(fù)濟(jì)組，治療8 d的創(chuàng)面愈合率低于正常對(duì)照組、MEBT/MEBO組、貝復(fù)濟(jì)組(P<0.05)，MEBT/MEBO組的平均創(chuàng)面愈合時(shí)間低于貝復(fù)濟(jì)組，但高于正常對(duì)照組(P<0.05)，MEBT/MEBO組和貝復(fù)濟(jì)組的治療8 d的創(chuàng)面愈合率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 四組治療8 d的創(chuàng)面愈合率和平均創(chuàng)面愈合時(shí)間比較

與模型對(duì)照組比較：1)P<0.05；與正常對(duì)照組比較：2)P<0.05；與貝復(fù)濟(jì)組比較：3)P<0.05；下表同

2.2四組TGF-β1、P-smad3蛋白表達(dá)比較 四組TGF-β1、P-smad3蛋白表達(dá)整體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，模型對(duì)照組的TGF-β1、P-smad3蛋白表達(dá)均低于正常對(duì)照組、MEBT/MEBO組、貝復(fù)濟(jì)組(P<0.05)，MEBT/MEBO組的TGF-β1、P-smad3蛋白表達(dá)低于正常對(duì)照組(P<0.05)，MEBT/MEBO組和貝復(fù)濟(jì)組的TGF-β1、P-smad3蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 四組TGF-β1、P-smad3蛋白表達(dá)比較

2.3四組β-catenin mRNA表達(dá)比較 四組β-catenin mRNA表達(dá)整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型對(duì)照組的β-catenin mRNA表達(dá)(0.34±0.13)低于正常對(duì)照組(1.14±0.21)、MEBT/MEBO組(1.08±0.26)、貝復(fù)濟(jì)組(0.85±0.13，均P<0.05)，MEBT/MEBO組的β-catenin mRNA表達(dá)高于貝復(fù)濟(jì)組(P<0.05)，MEBT/MEBO組與正常對(duì)照組的β-catenin mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

糖尿病足是導(dǎo)致糖尿病患者截肢、致殘的原因之一，我國(guó)有超過(guò)15%的糖尿病患者發(fā)生過(guò)足部潰瘍或壞疽〔5〕。糖尿病足潰瘍屬于慢性難愈型創(chuàng)面，創(chuàng)面愈合過(guò)程紊亂，難以及時(shí)、有序地對(duì)傷口進(jìn)行修復(fù)。糖尿病足潰瘍創(chuàng)面中具有多向分化潛能的表皮干細(xì)胞表達(dá)及生物活性減弱，降低了修復(fù)能力，同時(shí)糖尿病患者糖代謝紊亂，體內(nèi)產(chǎn)生糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖受到抑制；此外，糖尿病足患者體內(nèi)對(duì)創(chuàng)面愈合有重要調(diào)節(jié)作用的神經(jīng)肽P物質(zhì)含量較低，進(jìn)而抑制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的移動(dòng)，導(dǎo)致創(chuàng)面修復(fù)受阻〔6，7〕。美寶濕潤(rùn)燒傷膏是MEBT/MEBO的主要藥物，主要由黃芩、黃連、黃柏等組成，其中黃芩具有抗氧化、抗菌消炎、清除自由基等作用，黃連能抑制多種細(xì)菌、病毒、真菌的生長(zhǎng)，黃柏的主要活性成分小檗堿、巴馬汀能對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞起到保護(hù)作用，且美寶濕潤(rùn)燒傷膏可提供修復(fù)創(chuàng)面所需的營(yíng)養(yǎng)及生理濕潤(rùn)壞境，利于創(chuàng)面修復(fù)〔8〕。貝復(fù)濟(jì)是治療燒傷創(chuàng)面、體表慢性潰瘍、新鮮創(chuàng)面的常用藥，具有較好的臨床效果，其主要成分bFGF能刺激纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞生長(zhǎng)，具有廣泛的生物活性〔9〕。

本次研究說(shuō)明糖尿病足潰瘍創(chuàng)面由于受到糖尿病的影響較難恢復(fù)，同時(shí)MEBT/MEBO和貝復(fù)濟(jì)可促進(jìn)創(chuàng)面恢復(fù)，且MEBT/MEBO能更明顯降低創(chuàng)面愈合時(shí)間。另外，本研究還顯示，糖尿病足潰瘍大鼠的TGF-β1、P-smad3蛋白表達(dá)及β-catenin mRNA表達(dá)降低，創(chuàng)面恢復(fù)較慢可能與其存在一定關(guān)聯(lián)，且MEBT/MEBO可增強(qiáng)TGF-β1、P-smad3蛋白表達(dá)及β-catenin mRNA表達(dá)。TGF-β1是一種化學(xué)趨化因子，能參與炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞活性，TGF-β1在創(chuàng)面的新生肉芽組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，致使血液供應(yīng)受阻，不利于肉芽組織生長(zhǎng)，進(jìn)而延緩創(chuàng)面恢復(fù)〔10，11〕。smads蛋白是公認(rèn)的修復(fù)相關(guān)基因，smad3可通過(guò)與smad4形成復(fù)合物，促進(jìn)與創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)的靶基因的表達(dá)。P-smad3是活化后的smad3，可接收TGF-β1的刺激信號(hào)，使其可發(fā)揮正常的作用〔12，13〕。趙亞男等〔14，15〕研究結(jié)果顯示，Wnt/β-catenin信號(hào)通路下調(diào)可能是導(dǎo)致糖尿病足潰瘍創(chuàng)面難以愈合的重要途徑之一，而β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要調(diào)控因子。由此可見(jiàn)，TGF-β1、P-smad3和β-catenin對(duì)糖尿病足潰瘍創(chuàng)面的恢復(fù)有重要的影響，MEBT/MEBO可能是通過(guò)增強(qiáng)TGF-β1、P-smad3蛋白及β-catenin mRNA的表達(dá)促進(jìn)糖尿病足潰瘍創(chuàng)面的恢復(fù)。

綜上所述，MEBT/MEBO可促進(jìn)創(chuàng)面愈合，對(duì)糖尿病足潰瘍創(chuàng)面有較好的治療效果，其作用機(jī)制可能是MEBT/MEBO可增強(qiáng)TGF-β1、P-smad3蛋白及β-catenin mRNA的表達(dá)。