上官同琴

(鄭州市第九人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

糖尿病是一種以高血糖為典型特征的代謝紊亂性疾病。糖尿病分為四大類，即1型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)、其他特殊類型和妊娠期糖尿病，其中常見的是T2DM，約占糖尿病患者的90%。長期存在的高血糖導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙〔1～4〕。T2DM的特征在于胰島素抵抗和胰島素分泌受損情況下的高血糖。老年T2DM患者胰島素抵抗加重，身體虛弱，各種肌肉老化，器官更易衰竭，獨立生存能力受到影響，嚴重影響了生存質(zhì)量〔5〕。MicroRNA(miR)是一類20～24個核苷酸的高保守內(nèi)源性單鏈小分子非編碼RNA，大部分是通過結(jié)合靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(UTR)降解mRNA或抑制其翻譯，進而調(diào)節(jié)靶基因的表達，或與相關(guān)蛋白形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因表達的調(diào)控，決定了人體多種信號過程，包括增殖、分化及凋亡等一系列重要生命活動的進程，是一種重要的基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制〔3〕。因此，miR異常表達可能會導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生發(fā)展。目前，很多研究發(fā)現(xiàn)miR異常表達與糖尿病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)〔6～8〕。本研究旨在探索miR-29a在老年T2DM中的表達及作用。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng) 腎癌HEK-293T細胞系購自上海細胞研究所，用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2臨床病例 選擇 2014年8月至2016年3月鄭州市第九人民醫(yī)院腎內(nèi)科確診為T2DM的36例患者為研究對象。男16例，女20例；年齡50～76 歲，平均62.8 歲；40 例健康體檢者為對照組，男20例，女20例，年齡50～76歲，平均62.0歲。所有血清標本-80℃保存。本實驗獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.3主要試劑和儀器 Trizol LS Reagent、脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000 (美國Invitrogen公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；miR-29a 引物，miR-29a模擬物，miR-29a抑制劑，陰性對照(廣州銳博生物有限公司)；抗β-actin抗體，抗依賴性激酶2蛋白基因(CDKL2)抗體(美國Santa Cruz公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國全式金生物公司)；SYBR GreenMaster(日本TOYOBO公司)；pmir-Glo載體，雙熒光報告基因檢測試劑盒(美國promega公司)；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR)儀(美國 ABI 公司)；熒光發(fā)光檢測儀(美國promega公司)。

1.4細胞轉(zhuǎn)染 采用常規(guī)轉(zhuǎn)染方法，參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書，取對數(shù)生長期的HEK-293T細胞按2×105個/孔接種于6孔板上培養(yǎng)，待細胞融合70%～80%時，用LipofectamineTM2000試劑將miR-29a模擬物及陰性對照(無關(guān)序列)等轉(zhuǎn)染至HEK-293T細胞。

1.5qRT-PCR 利用Trizol LS Reagent提取血清中總RNA，然后用特異的miR-29a反轉(zhuǎn)引物將200 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后利用染料法qRT-PCR，檢測血清中miR-29a及內(nèi)參U6的含量。反應(yīng)條件： 95℃ 10 min預(yù)變性； 95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個循環(huán)。 miR-29a的相對表達量以 2-△△CT法計算。

1.6免疫蛋白印跡法 細胞轉(zhuǎn)染后48 h提取總蛋白質(zhì)，二喹啉甲酸法(BCA)定量后與蛋白上樣緩沖液混勻，100℃煮10 min，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜(NC)膜上，5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過夜，第二天三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)-吐溫(T)洗滌3～5次，每次10 min，之后加入二抗，室溫孵育1 h，TBS-T洗滌3～5次，每次10 min，之后進行顯影，定影。

1.7雙熒光報告系統(tǒng) 利用野生型CDKL2(3′-UTR上游引物：5′-CTAGCTAGCTTATGAGACTCTGGCCTCCCT-3′；下游引物：5′-ACGCGTCGACGGAGACAGGAACTTCTCTGG-3′)將CDKL2 3′-UTR的部分序列克隆到pmir-Glo載體螢火蟲熒光素酶基因的下游(CDKL2-pmir-Glo)。利用突變引物(突變型CDKL2 3′-UTR上游引物：5′-CCATGTATTGTAAGATTCTAGAGATGATGCTCCATA-3′；下游引物：5′-CATCTCTAGAATCTTACAATACATGGAACTAACCAA-3′)和點突變試劑盒將CDKL2 3′-UTR中的miR-29a結(jié)合位點進行突變(CDKL2-pmir-Glo-mut)。共轉(zhuǎn)染CDKL2-pmir-Glo和miR-29a的模擬物、抑制劑和相應(yīng)的陰性對照組及共轉(zhuǎn)染點突變后的CDKL2-pmir-Glo-mut和miR-29a的模擬物和陰性對照組。將HEK-293T細胞接種在48孔板貼壁后按各處理組進行轉(zhuǎn)染，48 h后收獲細胞進行雙熒光素酶測定。結(jié)果表示為相對熒光素酶活性〔螢火蟲熒光素酶熒光強度(LUC)/海腎LUC〕，重復(fù)實驗3次。

1.8噻唑藍(MTT)檢測細胞增殖實驗 將轉(zhuǎn)染24 h的HEK-293T細胞以3×103個/孔細胞接種于96孔板中，每孔體積100 μl，同時設(shè)置空白對照孔(只加培養(yǎng)基)，分別轉(zhuǎn)染mir-29a的模擬物和抑制劑，24 h后每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，至終濃度為1 mg/ml，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，37℃震蕩10 min，使結(jié)晶產(chǎn)物充分溶解，以空白孔調(diào)零，酶標儀562 nm測定各孔吸光度值(OD值)表示細胞增殖能力。每組取5孔平均值繪制增殖曲線，重復(fù)實驗3次。

1.9統(tǒng)計分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-29a在T2DM患者血清中低表達 相比于正常對照組miR-29a(3.6±1.4)，T2DM患者血清中miR-29a含量(2.5±1.3)明顯降低(P<0.05)。

2.2雙熒光素報告系統(tǒng)驗證miR-29a對CDKL2的靶向作用 與陰性對照組(3.94±0.18)相比，miR-29a模擬物轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性(1.97±0.43)顯著抑制(P<0.05)，與抑制劑對照組(3.71±0.15)相比，miR-29a抑制劑的熒光素酶活性(4.77±0.16)顯著增強(P<0.05)。與CDKL2-pmir-Glo-mut(3.92±0.12)相比，miR-29a模擬物和CDKL2-pmir-Glo共轉(zhuǎn)染細胞中的酶活性(2.08±0.31)顯著降低(P<0.05)。miR-29a模擬物能明顯抑制CDKL2蛋白表達，mir-29a抑制劑能夠促進CDKL2蛋白表達。見圖1。

2.3miR-29a抑制心肌細胞增殖 miR-29a模擬物轉(zhuǎn)染組(0.34±0.04)與陰性對照組(0.54±0.02)相比吸光度值明顯降低(P<0.01)；與抑制劑對照組(0.53±0.04)相比，miR-29a抑制劑轉(zhuǎn)染組(0.63±0.03)的吸光度值顯著提高(P<0.05)。

圖1 雙熒光報告驗證miR-29a對CDKL2的靶向作用

3 討 論

目前，T2DM的發(fā)病機制還不完全清楚，治療方法不成熟〔9〕。作為一項新技術(shù)新方法，深入研究miR的功能及作用機制，有望找到糖尿病治療的新靶點、新方法，并且能提高老年人生活質(zhì)量，減少養(yǎng)老負擔(dān)。很多研究報道了和糖尿病相關(guān)的miR，如在糖尿病大鼠模型中，miR-27b表達量顯著增加；同時大鼠血糖水平與miR20b的RNA水平存在負相關(guān)；對T2DM患者而言，miR-27b可能通過促進腎臟炎癥、纖維化等作用來損傷腎臟組織,導(dǎo)致腎功能損害的發(fā)生〔10～12〕。miR-29a在成熟組織中表達，尤其是心臟、腎臟和肺組織中表達明顯。miR-29a對葡萄糖的攝入和吸收及體內(nèi)葡萄糖的平衡有重要作用〔13〕。研究報道促炎性細胞因子處理的大鼠胰島β細胞中miR-29a/b表達量顯著上調(diào)，細胞凋亡率上調(diào)，推測促炎性細胞因子可能通過調(diào)節(jié)miR-29表達影響細胞凋亡功能，導(dǎo)致胰島β細胞凋亡，進而引發(fā)糖尿病〔14〕。對miR-29a功能研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a對HEK-293有明顯的抑制增殖作用。糖尿病病變一般累及腎臟，主要會導(dǎo)致腎小球和腎小管肥大、基膜增厚和細胞外基質(zhì)堆積，這些與細胞的增殖相關(guān)〔12,15,16〕。在糖尿病患者血清中，miR-29a表達明顯降低，可能會引發(fā)腎臟多種細胞過度增殖，從而引起細胞堆積和基底膜增厚等腎臟疾病，甚至導(dǎo)致腎功能異常。本研究說明miR-29a異常表達可能與T2DM及其并發(fā)癥有一定關(guān)系，這兩者之間的關(guān)系有待更深層次的探討。在miR的研究中，通過miRBase在線工具分析miR-29a序列。應(yīng)用TargetScan及miRNAda兩種計算方法預(yù)測miR-29a靶基因，并用熒光素酶報告技術(shù)來驗證miRNA的靶基因〔17,18〕。熒光素酶報告實驗的原理是以熒光素為底物來檢測螢火蟲熒光素酶活性的一種報告系統(tǒng)。pmir-Glo報告載體同時含有螢火蟲和海腎熒光素酶基因，可以簡單、快捷、靈敏地得出實驗數(shù)據(jù)〔19〕。本文提示miR-29a可能結(jié)合CDKL2的3′-UTR并抑制其表達和翻譯，從而影響其活性，Western結(jié)果提示細胞內(nèi)miR-29a表達水平發(fā)生改變時內(nèi)源性CDKL2蛋白表達水平也會隨之受到影響。對CDKL2與miR-29a結(jié)合位點進行點突變以影響兩者結(jié)合，結(jié)果提示點突變后miR-29a與CDKL2的3′-UTR結(jié)合受到影響，不能抑制CDKL2的轉(zhuǎn)錄和翻譯，也進一步確認了CDKL2的3′-UTR與miR-29a靶向關(guān)系。研究報道，CDKL家族是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶超家族，這類蛋白在細胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)發(fā)育等生物學(xué)進程中起到重要調(diào)控作用〔20〕。推測可能miR-29a靶向CDKL2之后調(diào)控細胞周期進程，從而抑制細胞增殖。

綜上，在T2DM患者血清中，miR-29a表達量明顯下調(diào)，CDKL2為miR-29a的作用靶點，miR-29a能明顯抑制HEK-293T細胞的增殖，具體機制有待進一步探討。