肖云 何淑怡 聶雙玉 張智偉 肖潔 吳峻

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1腎內(nèi)科，廣東 廣州 510120；2心血管內(nèi)科)

血管鈣化是心血管疾病(CVD)中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，它是慢性腎臟病(CKD)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。隨著患者腎功能下降，其血管鈣化發(fā)生率逐漸增加，鈣化程度加重，死亡風(fēng)險(xiǎn)亦明顯增高〔1〕。終末期腎病(ESRD)患者中，血管鈣化極為常見，有70%～90%的ESRD透析患者存在冠狀動(dòng)脈的鈣化〔2〕。血管鈣化常表現(xiàn)為平滑肌細(xì)胞向軟骨或成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在這一過(guò)程中，高磷和高鈣血癥的作用極為突出。骨橋蛋白(OPN)是鈣化血管中的骨基質(zhì)蛋白，是參與抑制血管鈣化的一個(gè)重要分子。研究發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)中鈣離子通道參與了血管鈣化的過(guò)程，抑制鈣離子通道可減少血管壁鈣的內(nèi)流和沉積，具有保護(hù)血管的作用〔3〕。已經(jīng)有研究提示二氫吡啶類的硝苯地平可延緩高血壓患者的冠狀動(dòng)脈鈣化〔4〕；還有學(xué)者在血管鈣化模型大鼠中應(yīng)用維拉帕米，結(jié)果發(fā)現(xiàn)維拉帕米可能通過(guò)抑制鈣離子內(nèi)流，同時(shí)抑制VSMCs內(nèi)sMad1、Runx2基因表達(dá)，從而改善VSMCs的鈣化〔5〕。目前臨床針對(duì) ESRD血管鈣化尚無(wú)公認(rèn)有效的治療方案，但積極預(yù)防有助于延緩疾病進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)用高磷、高鈣誘導(dǎo)VSMCs建立體外血管鈣化模型，并采用左旋氨氯地平進(jìn)行干預(yù)，探討鈣離子拮抗劑左旋氨氯地平對(duì)高鈣、高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化的保護(hù)作用。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs購(gòu)自美國(guó)ATCC公司)，10%胎牛血清(購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司)、DMEM培養(yǎng)液，青霉素-鏈霉素(購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司)，RNA提取試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司)，PCR引物(由上海生工公司合成)，抗β-actin和抗OPN(購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司)，SYBR Premix EX Taq試劑盒(購(gòu)自日本TaKaRa公司)，7900熒光定量PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)，左旋氨氯地平片由美國(guó)Pfizer公司提供。

1.2HASMCs培養(yǎng) 將實(shí)驗(yàn)所用的HASMCs加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，每1～2天換液1次。

1.3HASMCs鈣化的誘導(dǎo)及標(biāo)本留取 將HASMCs接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞約80%融合后分別改用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)：磷濃度為2.5 mmol/L的培養(yǎng)基(高磷組)，鈣濃度為2.8 mmol/L的培養(yǎng)基(高鈣組)，左旋氨氯地平濃度為10 mg·kg-1·d-1的培養(yǎng)基(左旋氨氯地平組)，磷2.5 mmol/L+左旋氨氯地平的培養(yǎng)基(高磷+左旋氨氯地平組)，鈣2.8 mmol/L+左旋氨氯地平的培養(yǎng)基(高鈣+左旋氨氯地平組)，磷1.4 mmol/L、鈣2.0 mmol/L濃度的培養(yǎng)基(對(duì)照組)。培養(yǎng)基培養(yǎng)0、2、4、6、8 d，收集各組細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣含量；培養(yǎng)第4、8天收集細(xì)胞提取RNA待做Real-time PCR；培養(yǎng)第8天收集細(xì)胞提取蛋白待做Western印跡。換用培養(yǎng)基的第1天定義為0 d。

1.4細(xì)胞內(nèi)鈣含量的測(cè)定 鈣含量的測(cè)定根據(jù)Wada等的方法進(jìn)行。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞3次，每孔再加用0.6 mol/L的鹽酸，在37℃條件下脫鈣24 h。吸取上清液，用全自動(dòng)生化分析儀比色法測(cè)定鹽酸懸液中的鈣含量(mmol/L)。脫鈣后的細(xì)胞再用PBS洗滌3次，加入0.1 mol/L的NaOH/0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶解細(xì)胞30 min，提取蛋白后用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。用蛋白含量標(biāo)化鈣含量(μg/mg蛋白)。

1.5用Real-time PCR檢測(cè)OPN mRNA表達(dá) 用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明，在10 μl反應(yīng)體系中行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；按照SYBR Premix EX Taq試劑盒說(shuō)明書配置PCR反應(yīng)體系，按下列公式計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量：目的基因相對(duì)表達(dá)量=2-△△CT(△CT=CT目的基因-CT內(nèi)參照；△△CT=△CT各樣本-△CT正常樣本)。各基因引物分別為：OPN正義鏈5′-GCCGACCAAGGAAAACTCACT-3′,反義鏈5′-GGCACAGGTGATGCCTAGGA-3′；β-actin正義鏈5′-TAAAGACGTTGACATCCGCC-3′,反義鏈5′-GGAGCCAGGGCAGTAATCT-3′。

1.6用Western印跡的方法檢測(cè)OPN蛋白表達(dá) 收集各實(shí)驗(yàn)組第8天細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液RIPA裂解細(xì)胞后取上清液，煮沸5 min，使蛋白變性；用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量；取40 μg蛋白加入等體積緩沖液中，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉后加入一抗、二抗，全自動(dòng)顯影機(jī)顯影后采用Band Scan圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及方差分析。

2 結(jié) 果

2.1左旋氨氯地平對(duì)高鈣、高磷誘導(dǎo)的HASMCs鈣沉積的影響 對(duì)照組、左旋氨氯地平組各時(shí)間點(diǎn)鈣含量無(wú)顯著差異(P>0.05)，高鈣組和高磷組的鈣含量自干預(yù)第2天開始升高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，鈣含量進(jìn)一步升高，第6天開始顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，同時(shí)間點(diǎn)高鈣+左旋氨氯地平組和高磷+左旋氨氯地平組與單純高鈣或高磷組相比，細(xì)胞內(nèi)鈣含量明顯下降(P<0.05)。見表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞內(nèi)鈣含量的檢測(cè)蛋白，n=3)

與同組第0天比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與高鈣組同時(shí)點(diǎn)比較：5)P<0.05；與高磷組同時(shí)點(diǎn)比較：6)P<0.05

2.2左旋氨氯地平對(duì)高鈣、高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞OPN mRNA表達(dá)的影響 與同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，高鈣組、高磷組的OPN mRNA表達(dá)水平明顯增高，第8天時(shí)增加最為明顯(P<0.01)；與高鈣組對(duì)比，高鈣+左旋氨氯地平干預(yù)組培養(yǎng)第8天時(shí)OPN mRNA水平明顯下降(P<0.01)，與高磷組對(duì)比，高磷+左旋氨氯地平干預(yù)后OPN mRNA表達(dá)亦明顯降低，干預(yù)第8天降低最為明顯(P<0.01)。見表2。

2.3左旋氨氯地平對(duì)高鈣、高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞OPN蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，高鈣或高磷培養(yǎng)第8天時(shí)，OPN蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組均明顯增高(P<0.01)；在高鈣或高磷培養(yǎng)液中同時(shí)加入左旋氨氯地平共同培養(yǎng)8 d，與高鈣或高磷組相比，OPN蛋白水平均明顯下降(P<0.01)。見圖1。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞內(nèi)OPN mRNA相對(duì)值

與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與高鈣組比較：3)P<0.01；與高磷組比較：4)P<0.01

1～6:對(duì)照組,高鈣組,高鱗組,左旋氨氯地平組,高鈣+左旋氨氯地平組,高鱗+左旋氨氯地平組圖1 各組細(xì)胞OPN蛋白表達(dá)

3 討 論

血管鈣化是心血管系統(tǒng)中發(fā)生的異常礦化，以磷酸鈣鹽沉積為主，是發(fā)生CVD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。與普通人相比，CKD患者更容易出現(xiàn)血管鈣化，其心血管事件死亡率也明顯升高。有研究表明〔6〕，40%～70%ESRD患者存在明顯冠狀動(dòng)脈疾病，血管鈣化增加ESRD患者的心血管事件，常常導(dǎo)致心功能不全、急性冠脈綜合征等嚴(yán)重后果。目前ESRD患者血管鈣化的確切機(jī)制尚未完全闡明，除了與傳統(tǒng)因素相關(guān)外，還可能與氧化應(yīng)激、內(nèi)分泌異常、促成骨因子的激活、血管鈣化抑制因子的缺乏、礦物質(zhì)代謝異常、骨代謝異常等有關(guān)〔7〕。已有很多研究表明高鈣、高磷在血管鈣化發(fā)生機(jī)制中的占有重要地位，而ESRD患者中普遍存在著鈣和磷的代謝失常，最終導(dǎo)致血管鈣化。高鈣和高磷如何引起血管鈣化，目前對(duì)其作用機(jī)制尚未明確，最近研究發(fā)現(xiàn)，高血鈣和血磷對(duì)促進(jìn)血管鈣化具有直接作用〔8〕，包括刺激骨或軟骨的分化、囊泡的釋放、細(xì)胞凋亡、抑制因子的消耗、細(xì)胞外基質(zhì)的降解。高磷血癥主要促進(jìn)VSMCs向骨和軟骨的分化，合成更多加快動(dòng)脈鈣化的蛋白，而高鈣血癥主要通過(guò)誘導(dǎo)VSMCs的凋亡和基質(zhì)小泡的釋放，促進(jìn)VSMCs的骨化，高鈣和高磷對(duì)刺激血管鈣化具有協(xié)同作用。本文選用體外培養(yǎng)的人VSMCs，在高鈣、高磷的誘導(dǎo)下建立體外血管鈣化模型。誘導(dǎo)2 d后，細(xì)胞的鈣沉積明顯升高提示建模成功。已有學(xué)者研究硝苯地平對(duì)血管鈣化的作用，Motro等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)，硝苯地平控釋片可明顯減少冠狀動(dòng)脈的鈣化，抑制冠狀動(dòng)脈的粥樣硬化的發(fā)展。Chen等〔9〕在牛VSMCs培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，維拉帕米可以減少VSMCs發(fā)生礦化作用，而硝苯地平作用并不明顯，并提示可能是通過(guò)降低堿性磷酸酶活性和基質(zhì)小泡的釋放起抑制血管鈣化作用。鈣拮抗劑可能是通過(guò)抑制VSMC增殖和遷移、減少細(xì)胞內(nèi)鈣離子的超負(fù)荷、抑制血管壁的鈣內(nèi)流及沉積、增加低密度脂蛋白(LDL)的清除和降解、抑制LDL的氧化、抑制血小板激活及保護(hù)內(nèi)皮功能等而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。左旋氨氯地平是二氫吡啶類鈣拮抗劑，在Sievers等〔10〕研究中顯示，與對(duì)照組相比，氨氯地平能明顯延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。而本實(shí)驗(yàn)中，合用左旋氨氯地平的高鈣組和高磷組在第6天開始HASMCs鈣沉積均明顯下降，且在第8天時(shí)下調(diào)了OPN基因和蛋白的表達(dá)?？梢?，左旋氨氯地平具有抑制VSMCs鈣化的作用，并與OPN的調(diào)節(jié)相關(guān)，本文推測(cè)左旋氨氯地平通過(guò)影響OPN的表達(dá)而參與血管鈣化的形成。

OPN是血管鈣化的重要抑制因子，是非膠原骨基質(zhì)蛋白的一種，在機(jī)體正常的情況下，OPN在巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中很少表達(dá)，近年來(lái)，學(xué)者發(fā)現(xiàn)ESRD患者血管鈣化周圍有OPN的表達(dá)。在體外的成骨細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)隨著礦化的進(jìn)行，OPN mRNA的表達(dá)水平逐漸升高，OPN隨著骨礦化不同階段的改變而變化〔11〕。Paloian等〔12〕敲除高磷飲食環(huán)境中大鼠的OPN基因，研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，缺乏OPN基因的大鼠更容易導(dǎo)致腎小管及間質(zhì)的鈣沉積和血管鈣化。本研究觀察到體外培養(yǎng)的高磷、高鈣濃度培養(yǎng)基中HASMCs的OPN mRNA及OPN蛋白表達(dá)均明顯增加，且高鈣組的OPN mRNA表達(dá)比高磷組早。左旋氨氯地平干預(yù)后HASMCs的OPN mRNA表達(dá)均明顯下降，且第8天所測(cè)OPN蛋白表達(dá)量對(duì)比高磷組和高鈣組也明顯下調(diào)，實(shí)驗(yàn)表明，高鈣、高磷誘導(dǎo)HASMCs鈣化的同時(shí)促進(jìn)OPN的表達(dá)。而使用左旋氨氯地平干預(yù)后能下調(diào)OPN mRNA和蛋白的表達(dá)，提示左旋氨氯地平降低HASMCs的鈣沉積可能是通過(guò)下調(diào)OPN的表達(dá)起作用。OPN 如何發(fā)揮抑制血管鈣化的作用尚不明確，推測(cè)可能是OPN通過(guò)抑制礦化組織中磷灰石結(jié)晶的生長(zhǎng)而減緩鈣化的進(jìn)程，而且使已經(jīng)發(fā)生鈣化部位的礦物質(zhì)溶解，促進(jìn)鈣結(jié)晶的重吸收。

綜上，高鈣、高磷誘導(dǎo)VSMCs鈣化，增加細(xì)胞OPN mRNA和蛋白的表達(dá)；左旋氨氯地平能夠降低高鈣、高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化，減少細(xì)胞OPN mRNA和蛋白的表達(dá)，提示左旋氨氯地平參與了血管鈣化的保護(hù)，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)OPN表達(dá)有關(guān)。