李巖 徐鳳 宋志慧 黃志寶 肖韓艷 呂游

(1牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗街醫(yī)院普外科，黑龍江 牡丹江 157000；2牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院老年病科；3牡丹江市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；4牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；5牡丹江醫(yī)學(xué)院)

神經(jīng)性疼痛是慢性疼痛的一種，病因復(fù)雜。目前研究發(fā)現(xiàn)外周神經(jīng)性疼痛或中樞性疼痛的根源是神經(jīng)系統(tǒng)損傷或功能障礙〔1，2〕。中樞敏化學(xué)說是近年來研究的熱點，中樞敏化在慢性疼痛的發(fā)生及長期維持中起重要作用，機制尚不清楚，特征為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的活化及相互作用〔3，4〕。目前神經(jīng)病理性疼痛缺乏有效的治療藥物。血管緊張素(Ang)Ⅱ受體拮抗劑在臨床上用于血壓控制，研究證實AngⅡ2型受體(AT2R)拮抗劑EMA401可治療帶狀皰疹后神經(jīng)痛〔5〕，但關(guān)于EMA401鎮(zhèn)痛機制不完全清楚。本實驗選用EMA401作用于神經(jīng)病理性疾痛慢性壓迫性損傷(CCI)模型大鼠，探討EMA401鎮(zhèn)痛作用的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物、 主要試劑及主要儀器 實驗動物：清潔級雄性 SD大鼠75只，體重230～270 g，由牡丹江醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。藥物和試劑：EMA401；放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液、Fluo-3AM檢測試劑盒、超敏電化學(xué)發(fā)光試劑盒(杭州，碧云天生物技術(shù)研究所)；抗β-actin小鼠單克隆抗體、抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)兔多克隆抗體(武漢，博士德生物工程有限公司)；抗活化轉(zhuǎn)錄因子(ATF)-3兔多克隆抗體、抗腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)兔多克隆抗體、羊抗兔磺基-花青素5羧酸(Cy5)熒光二抗兔疫球蛋白(Ig)G(美國，ABeam公司)；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒(北京原平皓生物科技有限公司)，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(上海生物科技有限公司)。主要儀器：凝膠成像系統(tǒng)GelDoe2000(Bio-Rad公司)，蛋白質(zhì)雙向電泳系統(tǒng)、高效液相色譜Agilent 1200(美國Bio-rad公司)，蛋白核酸分析儀Bio Photometer(德國Eppendorf公司)，電子von Frey 儀器(意大利 UGO BASILE 公司)，VonFrey 絲(美國 Stoelting 公司)；流式細胞儀 (Beckman coulter 公司)。

1.2模型建立 SD大鼠隨機分為5組，各15只，假手術(shù)(S)組、模型(M)組、低劑量(LD)組、中劑量(MD)組、高劑量(HD)組，S組只暴露坐骨神經(jīng)，不做結(jié)扎，其余各組顯露坐骨神經(jīng)主干，游離坐骨神經(jīng)主干，用4-0鉻制羊腸線環(huán)繞坐骨神經(jīng)主干做單結(jié)環(huán)扎，間隔1 mm結(jié)扎4道，至神經(jīng)外膜稍受壓，不影響神經(jīng)外膜血運為止，建立CCI模型〔6〕，于術(shù)后第1天開始，LD、MD、HD組連續(xù)14 d分別灌胃2、5、10 mg/kg EMA401，S組和M組大鼠每天灌胃等容量0.9%氯化鈉溶液。

1.3行為學(xué)檢測 檢測機械縮足反射閾值(PWMT)：分別于術(shù)前1 d，術(shù)后3、7、14 d，采用電子von Frey 儀器測定大鼠機械痛的 50%PWMT，室溫環(huán)境穩(wěn)定在22℃，將大鼠放置于升高的金屬網(wǎng)上，適應(yīng)30 min后，以一組強度遞增的纖維絲對大鼠足底進行機械刺激，陽性反應(yīng)為大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為，根據(jù)6次刺激的反應(yīng)進行計算，計算公式為：50%縮爪閾值=10logX+kδ(X：最后刺激使用的力度，k：不同刺激方式的系數(shù)，δ：各刺激力度值相鄰間距的平均數(shù))。力度范圍為0.45～15.00 g，超過50%PWMT直接記為15 g或0.45 g。

1.4背根神經(jīng)節(jié)(DRG)細胞內(nèi)Ca2+檢測 取手術(shù)側(cè)DRG加入RIPA蛋白裂解液，在4℃離心機中12 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細胞，按說明書稀釋Fluo-3 AM(終濃度為2 μmol/L)，向離心管加入Fluo-3 AM稀釋液，充分混勻后，37℃，孵育30 min，室溫，800 r/min離心5 min，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞，800 r/min離心，重復(fù)洗滌以充分去除Fluo-3 AM。流式細胞儀測量標記的陽性細胞數(shù)。

1.5Western印跡法半定量DRG中蛋白表達 剪取坐骨神經(jīng)，提取蛋白:術(shù)前1 d、術(shù)后3、 7、14 d PWMT檢測結(jié)束后，各組隨機取3只大鼠，取手術(shù)側(cè)DRG加入RIPA蛋白裂解液，在4℃離心機中12 000 r/min離心5 min，取上清液備用。Western印跡法灌膠后根據(jù)測定的總蛋白濃度計算，將等量的變性蛋白樣品按順序加入上樣孔內(nèi)，進行電泳后轉(zhuǎn)膜，用適當濃度的相應(yīng)一抗(β-actin 1∶400，GFAP 1∶400，ATF-3 1∶3 000)浸泡聚偏氟乙烯(PVDF)膜，4℃孵育過夜，洗滌后浸泡于1∶5 000的山羊抗兔IgG二抗，室溫搖床上孵育2 h。滴加化學(xué)發(fā)光試劑，顯影拍照后分析條帶光密度值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進行雙因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1PWMT 與S組相比，其他各組在手術(shù)后50%PWMT的結(jié)果在不同時間點有不同改變，M組50%PWMT隨時間逐漸下降(P<0.05)；LD組,MD組,HD組50%PWMT術(shù)后7 d降至最低，在術(shù)后第14天50%PWMT輕度上升；LD組,MD組,HD組術(shù)后50%PWMT的結(jié)果與M組、S組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2DRG內(nèi)Ca2+濃度的檢測結(jié)果 與S組比較，M組Ca2+濃度明顯升高(P<0.05)；與M組比較，LD、MD、HD組Ca2+濃度顯著降低(P<0.05)，見表1。

2.3Western印跡結(jié)果 與其他組相比，M組GFAP、ATF-3表達均呈高表達(P<0.05)，LD、MD、HD組GFAP、ATF-3表達與M組和S組相比有顯著差異(P<0.001)，見圖1。

表1 各組不同時點50%PWMT和Ca2+濃度的比較

與S組比較：1)P<0.05；與M組比較：2)P<0.05；與LD組比較：3)P<0.05

圖1 EMA401對GFAP和ATF-3蛋白表達的影響

3 討 論

2012年正常人體疼痛敏感度基因鑒定首次發(fā)現(xiàn)AngⅡ代謝通路在疼痛調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。AngⅡ與AT2R結(jié)合介導(dǎo)的血管擴張主要是通過緩激肽(EP)/一氧化氮(NO)/環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)級聯(lián)反應(yīng)完成的〔7〕，但其鎮(zhèn)痛作用不完全清楚，目前發(fā)現(xiàn)腹腔注射用AT2R拮抗劑后CCI大鼠PWMT升高，降低DRG中p38絲裂原活化蛋白酶(MAPK)及p44/42MAPK磷酸化水平，提示AT2R拮抗劑可能通過p38MAPK及p44/42MAPK通路調(diào)節(jié)CCI〔8〕。另有研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ不同受體在DRG神經(jīng)元腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達有不同效應(yīng)，AT1R抑制TNF-α表達，AT2R促進TNF-α表達，AngⅡ?qū)NF-α表達的效應(yīng)主要看AT1R/AT2R比率〔9〕。提示AngⅡ的鎮(zhèn)痛效應(yīng)可能與其抗炎作用有關(guān)。

GFAP是星形細胞活化的客觀標志蛋白之一〔10〕。ATF-3的表達也是促進軸突再生和神經(jīng)修復(fù)的關(guān)鍵因素之一，可以作為DRG神經(jīng)元活化的標志〔11〕。本實驗說明坐骨神經(jīng)縮窄引起脊髓中樞神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞活化。EMA401可能通過降低DRG中Ca2+濃度調(diào)節(jié)脊髓中樞敏化來抑制神經(jīng)性疼痛。研究發(fā)現(xiàn)辣椒素通過增加鈣內(nèi)流引起DRG神經(jīng)元興奮性增強，EMA401能劑量依賴性抑制這一反應(yīng)，并能被環(huán)磷酸腺苷(cAMP)翻轉(zhuǎn)〔12〕，提示EMA401通過減少cAMP抑制鈣內(nèi)流，減少了蛋白激酶C，磷脂酶C等多種鈣依賴酶的激活〔13〕，從而降低了脊髓中樞敏化，達到鎮(zhèn)痛效果。