梁沛余 段路路 吳穹

(1武漢大學研究生院，湖北 武漢 430070；2青海大學醫(yī)學院)

十八味訶子利尿丸，藏藥名為金尼阿如久杰日布，處方源自《藏醫(yī)醫(yī)訣補遺》，收錄于《衛(wèi)生部藥品標準·藏藥》(編號：WS3-BC-0182-95)，是由訶子、小檗皮、余甘子、蒺藜等十八味中藏藥材經(jīng)傳統(tǒng)工藝炮制而成的復方制劑〔1〕，是藏醫(yī)臨床常用降糖藥物之一。其構成藥材中，小檗皮、蒺藜、余甘子等有降糖效果〔2〕，但十八味訶子利尿丸復方對糖尿病的保護效能及作用機制尚未完全明確。本研究擬通過動物實驗先探求多次給藥法建立糖尿病(DM)大鼠模型的最佳間隔時間，隨后觀察十八味訶子利尿丸對DM大鼠多項指標的影響，分析其降糖作用，并初步探討作用機制，為藏醫(yī)臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物及分組 SD雄性大鼠40只，清潔級，質(zhì)量(240±20)g，蘭州大學實驗動物中心提供，批號：SCXK(甘)2009-0004，青海大學清潔級動物房內(nèi)飼養(yǎng)。實驗分為造模實驗與降糖實驗兩部分，造模實驗動物(16只)隨機等量分為A、B組，藏藥實驗動物(24只)隨機等量分為藏藥、模型及空白對照組。

1.2藥品及試劑 十八味訶子利尿丸(青海省格拉丹東藥業(yè)有限公司)；四氧嘧啶(北京索萊寶科技有限公司)；己糖激酶(HK)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；胰島素(INS)試劑盒(ADL公司)；0.9%氯化鈉注射液(湖南科倫制藥有限公司)；其余試劑由青海大學醫(yī)學院機能實驗室提供。

1.3主要儀器 羅康全活力型血糖儀(羅氏診斷產(chǎn)品中國有限公司)；離心機(美國Beckman公司)；PL3002電子天平(梅特勒-托利多儀器中國有限公司)；721型分光光度計(上海精密儀器有限公司)。

1.4方法

1.4.1造模實驗

1.4.1.1空腹血糖(FBG)測定 禁食不禁水12 h，A、B組均剪尾采血，快速血糖儀測定FBG水平。

1.4.1.2造模〔3〕A組采用腹腔注射四氧嘧啶(100 mg/kg)，間隔48 h補注(100 mg/kg)的多次給藥法造模；B組除間隔時間為24 h外，劑量和操作與A組一致。

1.4.1.3結(jié)果驗證 造模后(末次注射給藥3 d后)，測定大鼠FBG，以FBG>11.1 mmol/L為成模標準〔4〕。

1.4.2降糖實驗

1.4.2.1造模 根據(jù)造模實驗結(jié)果，在藏藥和模型組，選用合適的多次給藥法建立四氧嘧啶糖尿病大鼠模型，空白對照組除注射等量0.9%NaCl溶液外，其余操作與其他兩組一致。

1.4.2.2藥物干預 藏藥組給予十八味訶子利尿丸300 mg·kg-1·d-1干預，模型組和空白對照組均給予等量0.9%NaCl溶液干預，灌胃給藥5 d。

1.4.2.3指標測定 于藥物干預5 d后測定各組大鼠攝食量、飲水量、尿量及體質(zhì)量。于造模前、造模后、藥物干預5 d后測定各組大鼠FBG。于藥物干預5 d后，行腹主動脈采血，離心，取血清按試劑盒說明書規(guī)范化操作〔5〕，測定血清INS水平、SOD活性及MDA含量。于藥物干預5 d后，取肝組織制成10%的勻漿，按試劑盒說明書測定肝臟HK、SDH活力。上述指標測定前大鼠均禁食不禁水12 h。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件，造模實驗組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗；降糖實驗組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1造模實驗結(jié)果 A組、B組造模前FBG水平比較差異無統(tǒng)計學意義〔(5.45±0.53)、(5.35±0.31)mmol/L，P>0.05〕；B組造模后FBG〔(24.33±2.51)mmol/L〕相比A組〔(6.50±0.73)mmol/L〕及造模前均提高顯著(均P<0.05)，且符合DM標準，故采用腹腔注射四氧嘧啶(100 mg/kg)、間隔24 h補注(100 mg/kg)的多次給藥法可建立四氧嘧啶DM大鼠模型。8只大鼠全部成模。

2.2降糖實驗結(jié)果

2.2.1十八味訶子利尿丸對DM大鼠攝食量、飲水量、尿量及體重的影響 模型組大鼠出現(xiàn)“三多一少”(多飲、多食、多尿、體重減輕)典型癥狀(P<0.05)，使用十八味訶子利尿丸干預后可使上述癥狀明顯改善(P<0.05)。見表1。

2.2.2十八味訶子利尿丸對DM大鼠FBG的影響 DM模型組大鼠FBG水平迅速提升(P<0.05)，十八味訶子利尿丸有良好的降糖效果(P<0.05)，可減弱高糖環(huán)境對機體的損害作用。見表1。

2.2.3十八味訶子利尿丸對DM大鼠血清INS的影響 模型組血清INS水平〔(14.6±3.0)mU/L〕明顯低于空白對照組〔(48.3±5.6)mU/L,P<0.05〕，十八味訶子利尿丸可在一定程度上減弱四氧嘧啶對胰島β細胞的毒害作用，增加胰島素的分泌〔(19.5±3.6)mU/L,P<0.05〕。

2.2.4十八味訶子利尿丸對DM大鼠肝臟HK、SDH活力的影響 DM發(fā)病過程中可出現(xiàn)HK、SDH活力下降(P<0.05)，繼而影響機體對葡糖糖的攝取和利用；十八味訶子利尿丸可改善代謝酶活力(P<0.05)，促使糖代謝的正常發(fā)生。見表2。

2.2.5十八味訶子利尿丸對DM大鼠血清SOD活性及MDA含量的影響 DM的發(fā)生可下調(diào)機體內(nèi)SOD活性(P<0.05)，加速MDA的生成(P<0.05)；十八味訶子利尿丸可提高機體抗氧化能力(P<0.05)，減輕自由基損害。見表3。

表1 各組攝食量、飲水量、尿量、體重及各時間點FBG水平比較

與空白對照組相比：1)P<0.05；與模型組相比：2)P<0.05；下表同

表2 肝臟HK、SDH活性比較

表3 血清SOD活性、MDA含量比較

3 討 論

高血糖使機體組織持續(xù)存在于氧化應激微環(huán)境，活性氧簇(ROS)、活性氮(RNS)等生成增多，遠遠高于自身清除量，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，組織器官受損。當前研究〔6〕顯示，氧化應激在DM發(fā)病機制中舉足輕重。干預氧化應激〔7〕、削弱DM損害已成為當前研究熱點之一。在DM進程中，氧化應激與胰島功能的下降關系密切〔8〕。目前認為其損傷途徑主要有：(1)ROS的直接損害作用：ROS可直接在胞膜上發(fā)生過氧化反應，產(chǎn)物的蓄積可破壞膜結(jié)構，使胰島β細胞信號轉(zhuǎn)導功能障礙，胰島功能受損；ROS可使β細胞內(nèi)有生物學效應的蛋白質(zhì)、酶類等結(jié)構改變，影響胰島β細胞正常生命活動；ROS可氧化線粒體內(nèi)膜心磷脂，促使其進入胞質(zhì)，活化caspase-3等凋亡蛋白，加速胰島β細胞的凋亡進程。(2)核因子(NF)-κB通路激活：高糖環(huán)境使ROS積聚，通過調(diào)控胰島β細胞NF-κB通路，使信號轉(zhuǎn)導功能異常，損傷胰島β細胞，加重DM病情。胰島素促進因子(PDX)-1是調(diào)控INS合成分泌的重要因子，胰島β細胞內(nèi)ROS的積聚會下調(diào)PDX-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，減少PDX-1合成，直接致使INS合成分泌不足〔9〕。c-Jun氨基末端激酶(JNK)亦是調(diào)控PDX-1的重要因子，氧化應激過程中JNK可通過激活的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路下調(diào)PDX-1的表達，從而進一步影響INS的合成分泌〔10〕。MDA是脂質(zhì)過氧化反應終末產(chǎn)物，其生成量是機體過氧化進程的直接反映，其水平升高提示機體內(nèi)氧化損傷加重。SOD是體內(nèi)清除ROS的重要抗氧化酶，正常狀態(tài)下，ROS的積聚量與清除量相當，在內(nèi)環(huán)境中時刻處于平衡狀態(tài)〔11〕。DM的發(fā)生可使機體內(nèi)SOD活性迅速衰退，ROS、RNS、自由基等大量蓄積，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)破壞，加速MDA的生成，嚴重干擾機體正常代謝活動，造成胰島β細胞受損、INS分泌不足及多靶點器官損害〔12〕。在葡萄糖攝取利用障礙方面，代謝酶活力下調(diào)亦是促進DM進展的重要因素。HK是糖代謝過程中的一個關鍵酶，可催化葡萄糖磷酸化，生成葡萄糖-6-磷酸，是糖代謝過程中的重要限速酶。DM發(fā)病過程中，多種毒害作用會使肝臟HK活力下降，大量葡萄糖不能順利進入肝糖原合成通路，從而發(fā)生積聚，是高糖狀態(tài)發(fā)生的重要原因。SDH是線粒體的標志酶，是三羧酸循環(huán)過程中葡萄糖被利用釋能的關鍵酶，在DM進展中起著重要作用。本研究通過造模實驗證實24 h間隔給藥法可建立DM大鼠模型，為DM模型的建立提供了一定數(shù)據(jù)支持；但四氧嘧啶造模過程中動物個體耐受性差異較大，容易致死，故四氧嘧啶造模方法仍有待進一步完善。降糖實驗證實十八味訶子利尿丸有著良好的降糖效果，可促進胰島功能修復，增加INS的合成分泌，減輕“三多一少”癥狀，對抗DM的發(fā)生、發(fā)展過程，促進良好轉(zhuǎn)歸。十八味訶子利尿丸可提升DM個體SOD活力，負性調(diào)控MDA的生成，促使機體對ROS、自由基等的清除能力上調(diào)，減少DM對機體的損害，說明其降糖機制與提高機體抗氧化能力、減輕胰島損害有關；同時，十八味訶子利尿丸可提升代謝酶活性，促進肝糖原的合成，加快葡萄糖的氧化釋能，證實其降糖作用亦與促進機體對葡萄糖的攝取利用過程關系密切。

綜上，十八味訶子利尿丸對四氧嘧啶糖尿病大鼠有一定的保護作用，但由于DM發(fā)病及治療機制極為復雜，故其具體保護機制仍需進一步研究。